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Rodriguez, Arlene; Lleonart, Ricardo; Martinez, Ana S.; Reyes, Geovani; Gonzalez, Ernesto & Brito, Jose E. Resumen Utilizando el clasico metodo de seleccion para el fenotipo de modificacion, se aislaron los genes que codifican para la restrictasa y la metilasa Hinf I. Se utilizo el plasmido pUC18 para la construccion de la libreria genomica, asi como para la expresion de estas proteinas en Escherichia coli . El clon obtenido a partir del proceso de seleccion (pERHinf4) mostro expresion de la restrictasa en la cepa de E. coli HB101. Los extractos celulares obtenidos a partir de esta cepa transformada mostraron el doble de la cantidad (U/g de biomasa) de restrictasa que usualmente contienen los de la cepa Haemophilus influenzae Rf. En este trabajo describimos un procedimiento de purificacion de esta restrictasa recombinante expresada en E. coli. Este procedimiento permite obtener una preparacion libre de fosfatasas y exonucleasas contaminantes, con un recobrado final de enzima equivalente al 33% de la actividad total presente en el extracto.

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Cloning and expression of genes coding for Haemophilus influenzae Rf restriction and modification enzymes: Purification of the recombinant endonuclease Rodriguez, Arlene; Lleonart, Ricardo; Martinez, Ana S.; Reyes, Geovani; Gonzalez, Ernesto & Brito, Jose E. Abstract The genes coding for Hinf I restriction and modification enzymes were cloned from the Haemophilus influenzae Rf strain using pUC18 plasmid as vector. To select the genes from the library, the classical modification phenotype selection was used. When introduced into Escherichia coli HB101 strain, the recombinant plasmid pERHinf4 was able to direct the expression of the restriction phenotype. The crude extracts from the transformed E. coli contained roughly twice the amount of restrictase expressed by the natural source. A purification procedure for the restrictase is described which when applied to the recombinant enzyme, renders a preparation free of contaminant exonucleases and phosphatases. The overall recovery of the purification procedure was about 33% of the total activity. Keywords Hinf I, Methylase, Restrictase, Restriction-Modification System

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