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Implementation of a Method to Determine Lolitrem-B in Ryegrass ( Lolium perenne L.) by Liquid Chromatography (HPLC) Moyano, Stella A.; Lanuza, Francisco A.; Torres, Alfredo B.; Cisternas, Ernesto A. & Fuentes, Marcela V. Abstract Lolitrem-B is a neurotoxic substance that causes the ryegrass staggers syndrome in cattle, sheep, and horses consuming ryegrass ( Lolium perenne L.) infected with endophytic fungus Neotyphodium lolii (Latch, Christensen, and Samuels) Glenn, Bacon, and Hanlin. Due to the increasing use of ryegrass pasture in southern Chile, it is necessary to know the content of lolitrem-B to optimize grazing management and reduce the effect on animal health. The objective of this study was to implement a method to determine lolitrem-B in ryegrass. Ryegrass samples were used without the endophyte, freeze-dried, and kept in darkness at -18 ºC to establish the method. Then, a pure lolitrem-B standard was added and the toxin was extracted with a mixture of chloroform-methanol (2:1), purified in manually prepared silica gel 60 columns. Five standard addition levels were studied (0.05, 0.10, 0.30, 0.60, and 1.00 mg kg-1) with five replicates per level. The recovery was 96.6 to 99.9%, on average and the coefficient of variation (CV) ranged between 0.9 and 5.9%. Quantification was done by high-performance liquid chromatography (HPLC) and fluorescence detection. The quantification limit was 0.05 mg kg-1. This method of determining neurotoxin lolitrem-B in ryegrass samples was implemented for the first time in Chile. It is fast and inexpensive; it has good precision, accuracy and repeatability. Keywords mycotoxin, neurotoxin, endophyte fungi, Neotyphodium lolii

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Implementación de un Método para la Determinación de Lolitrem-b en Ballica ( Lolium perenne L.) por Cromatografía Líquida (HPLC). Moyano, Stella A.; Lanuza, Francisco A.; Torres, Alfredo B.; Cisternas, Ernesto A. & Fuentes, Marcela V. Resumen El lolitrem-B es una sustancia neurotóxica causante del síndrome "ryegrass staggers" o temblor de las ballicas en bovinos, ovinos y equinos que consumen ballicas perennes ( Lolium perenne L.), infectadas con el hongo endófito Neotyphodium lolii (Latch, Christensen y Samuels) Glenn, Bacon y Hanlin. Debido al creciente uso de praderas con estas especies en el sur de Chile, es necesario conocer el contenido de lolitrem-B para realizar un adecuado manejo del pastoreo y evitar la intoxicación de los animales. El objetivo de este estudio fue implementar un método para la determinación de lolitrem-B en ballicas. Para establecer el método se utilizaron muestras de ballica sin endófito que fueron liofilizadas y mantenidas en oscuridad a -18 °C. Se adicionó estándar puro de lolitrem-B y la extracción de la toxina se hizo con una mezcla de cloroformo-metanol (2:1), purificándose el extracto en columnas de silicagel 60, preparadas manualmente. Se estudiaron cinco niveles de adición de estándar, con cinco repeticiones por nivel (0,05; 0,10; 0,30; 0,60 y 1,00 mg kg-1). El porcentaje de recuperación promedio fue de 96,6 a 99,9% y el coeficiente de variación (CV) promedio varió entre 0,9 y 5,9%. La cuantificación se hizo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y detección por fluorescencia. El límite de cuantificación fue de 0,05 mg kg-1. Este método, para la determinación de la neurotoxina lolitrem-B en muestras de ballica, fue implementado por primera vez en Chile. Es rápido y de bajo costo, presentando una buena precisión, exactitud y repetibilidad. Palabras-clave micotoxina, neurotoxina, hongo endófito, Neotyphodium lolii

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