Agricultura Técnica Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA ISSN: 0365-2807 EISSN: 0717-6333 Vol. 61, Num. 1, 2001, pp. 42-50

Agricultura Técnica (Chile), Vol. 61, No. 1, Jan-March, 2001, pp. 42-50

DETECCIÓN DE UN DEFECTO GENÉTICO EN BOVINOS MEDIANTE UNA PRUEBA DE ADN.¹

Detection of a bovine genetic defect by a DNA probe

Ricardo Felmer D. ², Norberto Butendieck B.², Bárbara Butendieck B.² y Juana Villegas M.³

¹ Recepción de originales: 11 de marzo de 1999.
² Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Carillanca, Casilla 58 – D, Temuco, Chile. E-mail: nbutendi@carillanca.inia.cl
³ Universidad de La Frontera, Departamento de Medicina Interna, Casilla 54 – D, Temuco, Chile.

Code Number: at01005

ABSTRACT

The adhesion deficiency of bovine leukocytes to antigens, known as BLAD (bovine leukocyte adhesion deficiency), is a hereditary genetic disease which is lethal for the Holstein breed. It is a recessive autosomal disease that can be transmitted to the offspring. The objective of this research was to standardize the molecular techniques to diagnose BLAD and also to get a first approximation of the genetic frequency of the mutated allele in the bull population of the IX^th and X^th Regions. DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR) and posterior digestion with restriction enzymes Taq I and Hae III was performed. The digested product was analyzed by 4% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining to show the typical restriction fragments present in normal, carrier and infected cattle. The technique was validated with a screening test of 59 cattle. Out of 55 bulls analyzed, one turned out to be a BLAD carrier, which suggests a genetic frequency of 1.79% in the bull population of the IX^th and X^th Regions. The diagnostic technique of PCR and the digestion of the amplification product with two restriction enzymes (Taq I and Hae III) has identified with accuracy the genotype of cattle at a specific locus and allows an early identification of the genetic defect known as BLAD in infected and carrier animals.

Key words: bovine leukocyte adhesion deficiency, BLAD, PCR, Holstein breed, RFLP, disease.

RESUMEN

La deficiencia en la capacidad de unión de leucocitos bovinos a los antígenos, más conocida como BLAD, es una enfermedad hereditaria que resulta letal para el ganado de la raza Holstein. Su principal característica es ser una enfermedad autosómica recesiva que puede ser transmitida a la descendencia. El objetivo del trabajo fue estandarizar la metodología para realizar un diagnóstico de la enfermedad mediante técnicas moleculares y lograr una primera aproximación sobre la frecuencia génica del alelo mutado en algunas poblaciones de toros de la IX y X Región. En base a la amplificación del ADN mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y posterior digestión con enzimas de restricción Taq I y Hae III, fue posible visualizar, mediante electroforesis en gel de agarosa al 4%, los fragmentos de restricción característicos para bovinos normales, portadores o enfermos. La técnica se validó mediante un muestreo de 59 bovinos. De los 55 toros analizados uno resultó ser portador de BLAD, lo que implica una frecuencia génica de 1,79% en la población de toros de la IX y X Región. La técnica de PCR acoplada a la digestión con enzimas de restricción (Hae III y Taq I) ha demostrado que identifica inequívocamente el genotipo del ganado en un locus determinado y permite el diagnóstico certero y precoz de aquellos animales enfermos y/o portadores del defecto hereditario conocido como BLAD.

Palabras claves: deficiencia de adhesión leucocitaria bovina, BLAD, PCR, RFLP, Holstein, enfermedad.

INTRODUCCIÓN

Una granulocitopatía bovina, conocida actualmente como BLAD (Bovine leuckocyte adhesion deficiency o deficiencia de adhesión leucocitaria bovina) fue descrita por primera vez en una vaquilla Holstein Friesian por Hagemoser et al. (1983) en EEUU. Esta patología se caracterizó por una susceptibilidad aumentada a la acción de agentes infecciosos durante los dos años de vida del animal. Estos autores documentaron en el animal estudiado una función alterada de los neutrófilos. Pese a una alta neutrofilia era incapaz de iniciar una respuesta inflamatoria. Posteriormente Nagahata et al. (1987) describieron en Japón una enfermedad similar, caracterizada por un síndrome granulocitopático, que afectó a terneros y vaquillas Holstein Friesian descendientes de ganado proveniente de EE.UU. Takahashi et al. (1987), en base a un análisis de pedigrí, sugirieron como causa del síndrome granulocitopático una enfermedad con un mecanismo de transmisión hereditario de tipo recesivo autosomal simple.

En 1990 Kehrli et al. definieron la base molecular de la granulocitopatía bovina como una deficiencia del complejo glicoproteína Mac-1 (CD11b/CD18). Dentro de las manifestaciones clínicas y hallazgos de laboratorio de la enfermedad se pueden señalar: a) infecciones recurrentes de tejidos blandos, como estomatitis granulomatosa y ulcerativa, enteritis, neumonitis, periodontitis; b) cicatrización defectuosa; c) muerte temprana; d) leucocitosis donde predominan los neutrófilos; neutrofilia persistente y progresiva; linfocitosis moderada; e) neutrófilos funcionalmente anormales en cuanto a motilidad, fagocitosis y capacidad oxidativa. A la necropsia se observan numerosos neutrófilos en capilares sinusoides y vasos sanguíneos, contrastando con el bajo número de neutrófilos extravasculares en los tejidos inflamados y en los que se puede observar sobrecrecimiento de microorganismos. Las lesiones histopatológicas más frecuentemente registradas son enteritis necrótica, hiperplasia linfoide e histiocitosis de los ganglios linfáticos. En muchos casos el examen histológico confirmó lesiones macroscópicas de neumonía o abscesos pulmonares. También se han diagnosticado laringitis y traqueitis así como hiperplasia mieloide de la médula ósea (Gilbert et al., 1993).

El BLAD es una enfermedad hereditaria que resulta letal para el ganado de la raza Holstein (Kehrli et al., 1992). Una enfermedad equivalente existe en el humano denominada "deficiencia de adhesión leucocitaria humana" (LAD), así como en perros de la raza Setter Irlandés, que presentan una deficiencia genética en las glicoproteínas LFA-1, Mac-1 y p150, 95, denominadas también CD11/CD18 por la Organización Mundial de la Salud. Shuster et al. (1992) secuenciaron el gen normal para la proteína bovina CD18, que codifica para la subunidad b de las integrinas, e identificaron el alelo bovino CD18 defectuoso. Se trata de 2 mutaciones puntuales dentro del alelo que codifica CD18 en el bovino. Una es silenciosa y la segunda mutación consiste en el cambio de ácido aspártico por glicina en el aminoácido 128, que corresponde a la región extracelular, altamente conservada, tanto en el humano, bovino y ratón. La mutación genética afecta la función de un receptor de proteínas en los leucocitos. Las reacciones de adherencia leucocitaria son importantes en la respuesta inflamatoria y en la defensa del organismo contra infecciones. En esta función participan las ß ₂ integrinas, una familia de glicoproteínas integrales de la membrana de los leucocitos constituida por la subunidad a (CD11a, CD11b y CD11c) y b (CD18) y que se agrupan en: - CD11a CD18 (LFA-1), receptor para ICAM-1 en el endotelio vascular; - CD11b CD18 (Mac-1), receptor para C3bi (fagocitosis opsónica); - CD11c CD18 (p150, 95), receptor para C3bi y fibrinógeno.

Cuando un bovino es afectado por una infección, los leucocitos son atraídos al tejido afectado y combaten a los microorganismos invasores. Los leucocitos son atraídos al sitio de la infección por moléculas que aparecen en las paredes de los vasos sanguíneos de la zona afectada. Para poder penetrar al tejido infectado los leucocitos usan uno de sus receptores para adherirse a estas moléculas y fijarse a ellas, para poder atravesar la pared vascular y llegar al tejido infectado. La mutación asociada al BLAD modifica el receptor de los leucocitos, de modo que pierden su capacidad de fijarse a las paredes vasculares para llegar al tejido infectado. Como consecuencia, los bovinos afectados no pueden combatir enfermedades bacterianas comunes, las cuales pueden persistir o recurrir. Su principal característica es ser una enfermedad autosómica recesiva y por tanto capaz de transmitirse desde padres portadores a su descendencia. Los terneros afectados sufren de infecciones recurrentes especialmente de los tejidos blandos (enteritis, neumonitis, periodontitis, etc.), los cuales ya sea fallan en la respuesta a la infección o recaen luego de un tratamiento convencional, muriendo normalmente antes de alcanzar la madurez sexual.

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988) acoplada a la digestión con enzimas de restricción (RFLP) ha demostrado que identifica inequívocamente el genotipo del ganado en un locus determinado (Kehrli et al., 1990; Shuster et al., 1992; Tammen et al., 1996; Felmer y Butendieck, 1996).

El objetivo del presente trabajo tiene por finalidad estandarizar la metodología de Walsh et al. (1991), y Tammen et al. (1996) para realizar un diagnóstico certero y precoz de aquellos animales enfermos y/o portadores del defecto hereditario conocido como BLAD, y establecer una primera aproximación de la frecuencia génica del alelo mutado en la población de reproductores bovinos producidos por criaderos de la IX y X Región.

MATERIALES Y MÉTODOS

a) Obtención de muestras.

Se utilizaron muestras de sangre de 37 toros de la raza Frisón Negro Chileno y de 3 vacas de la misma raza, cuyos pedigríes permitían sospechar la presencia de ejemplares portadores de esta enfermedad, en atención a que eran descendientes de toros pertenecientes a centros de inseminación, que posteriormente se identificaron en los correspondientes catálogos como portadores de BLAD. Todos estos animales pertenecían al Centro Regional de Investigación (CRI) Carillanca, ubicado en el valle central de la IX Región, comuna de Vilcún, distante 20 km de Temuco. Además se utilizaron 19 muestras de sangre de toros seleccionados para ser evaluados para inseminación artificial, representativos de algunos criaderos ubicados en la IX y X Región. La obtención de las muestras de sangre se realizó de acuerdo a métodos convencionales de extracción (5 a 10 mLpor animal), usando como anticoagulante 1,5 mg mL^-1 EDTA-potásico.

b) Extracción de ADN.

El aislamiento y purificación de ADN a partir de sangre total se realizó de acuerdo al método descrito por Winberg (1991), el cual rinde ADN en cantidad y calidad suficientes para la reacción de polimerasa en cadena (PCR). Este fue el procedimiento de extracción utilizado inicialmente y aplicado a las tres vacas. En los toros se utilizó un método alternativo de extracción de ADN a partir de sangre total, el cual no requiere de extensivas etapas de purificación, descrito por Walsh et al. (1991), en el cual se aprovecha la capacidad quelante que tiene la resina Chelex-100 para extraer ADN desde células sanguíneas. La diferencia fundamental con el método descrito por Walsh et al. (1991), radica en la separación previa de los leucocitos de la sangre mediante lisis selectiva de los eritrocitos y separación de los leucocitos mediante centrifugación.

c) Amplificación de ADN in vitro.

En base a la secuencia del ADNc del gen C18 del bovino (M81233, número de acceso de la base de datos GenBank) se sintetizaron (Centro de Síntesis de Oligonucleótidos) y utilizaron los oligonucleótidos o partidores descritos por Tammen et al. (1996), (5’-GTCAGGCAGTTGCGTTCAA-3’) y (5’-GAGGTCATCCACCATcGAGT-3’). Este último presenta un cambio en una base, por lo cual introduce en el producto de amplificación, un nuevo sitio de restricción para la enzima Taq I, con lo cual se obtiene un producto de amplificación de 101 pb de dicho gen. La reacción estándar de PCR para un volumen final de 30 m L^-1 contiene: 1X de Tampón de PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,3 y 25 mM MgCl₂), 100 m M de cada dNTP, 0,75 U de Taq ADN Polimerasa, (Gibco BRL), 0,2 m M de cada partidor, 30 ng de ADN y H₂O desionizada estéril hasta completar volumen. Las muestras se amplificaron en un Termociclador Perkin-Elmer 9700. El perfil termal utilizado corresponde básicamente al método descrito por Tammen et al. (1996), modificado en los ciclos y temperaturas en atención a los resultados obtenidos. Los valores indicados por Tammen et al. (1996) se señalan entre paréntesis. Se inicia la reacción con la desnaturalización a 94°C/5 min, seguida de 10 ciclos, donde cada ciclo consta de la desnaturalización a 94°C durante 30 seg, la fase de hibridación a 60°C (56ºC) durante 60 seg y la fase de extensión a 72°C durante 30 seg, seguidos de 27 (25) ciclos a 90°C/30 seg, 60°C (56ºC)/60 seg, 72°C/30 seg, para finalizar con una extensión de 72°C/5 min.

d) Digestión del producto amplificado

Para diferenciar las variantes alélicas se utilizaron dos endonucleasas de restricción. Para ello se tomaron del producto de amplificación 10 m L que fueron transferidos a dos tubos sometiéndolos a reacción, adicionando en un tubo 5 U de Hae III y en el otro 5 U de Taq I (Gibco BRL) y 10% del volumen final de reacción del tampón 10X React 2 de Gibco BRL (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 10 mM MgCl₂; 50 mM NaCl; 1 mM DTT) a cada uno de ellos. Se continuó con la incubación de 1 h a 37°C para Hae III y a 65°C para Taq I (Tammen et al., 1996). La reacción se detuvo agregando 1 m L de tampón de carga (0,25% azul de bromofenol, 0,25% de xilen cyanol, 30% de glicerol) y tampón TAE 6X. La identificación del genotipo para cada muestra se realizó por visualización de las bandas de ADN producidas después de la digestión del producto amplificado y la separación de ellas mediante electroforesis en geles de agarosa al 4% (Nusieve GTG, FMC), en tampón TAE 1X (Tris-acetato 0,04 M pH 8,0 y EDTA 1 mM), con un voltaje de 2,5 V cm^-1 durante 2 h (Figura 1). Finalmente los geles se tiñeron con bromuro de etidio 0,5 m g mL^-1 y se fotografiaron en un transiluminador UV.

e) Frecuencias génicas y genotípicas

Las frecuencias génicas y genotípicas se calcularon de acuerdo a Li (1968).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La identificación del alelo mutado versus el alelo normal (genotipo del animal en estudio) para el locus CD18, responsable de la enfermedad genética conocida como BLAD, se realizó mediante la amplificación por PCR de un fragmento de 101 pb del gen CD18 y posterior digestión del fragmento amplificado por las enzimas de restricción Taq I y Hae III (Figura 2) (Shuster et al., 1992; Tammen et al., 1996).

En el Cuadro 1 se indica el tamaño en pares de bases que deben tener los fragmentos de restricción en bovinos normales, portadores y enfermos de BLAD. Los fragmentos de ADN generados a partir de la digestión se distinguieron claramente luego de la electroforesis en agarosa al 4% (Figura 1). La metodología descrita y probada demostró ser efectiva para identificar el alelo mutado del locus CD18, conforme a lo descrito por Kehrli et al. (1990) y Shuster et al. (1992). De esta forma es factible separar a aquellos individuos portadores evitando así que se continúe con la transmisión de esta deficiencia genética en la progenie.

Cuadro 1. Patrón de las bandas de los fragmentos de restricción (pb) posterior a la digestión con enzimas Taq I y Hae III.

Table 1. Banding pattern of the restriction fragments (bp) after enzyme digestion with Taq I and Hae III.

TL= Normal; BL= Heterocigoto (portador); BLAD= Homocigoto (enfermo).

Los resultados que se muestran en el Cuadro 2 establecen, que de los 56 toros analizados, uno resultó ser portador de esta deficiencia genética. En cambio, de las 3 vacas sospechosas, se determinó que dos de ellas eran portadoras del alelo mutado. No se consideraron las vacas en el cálculo de la frecuencia génica por ser un número no significativo y pertenecer a un solo predio.

Cuadro 2. Screening de animales para la enfermedad genética BLAD (deficiencia de adhesión de leucocitos bovinos)

Table 2. Screening results of the tested cattle for BLAD ( bovine leucocyte adhesion deficiency).

TL= Normal; BLAD= Homocigoto (enfermo); BL= Heterocigoto (portador).

El análisis de los datos aportados por los 56 toros permite señalar que la frecuencia genotípica de los toros portadores de la enfermedad, en los criaderos de la IX y X Región, es del 1,79%, y la frecuencia génica o alélica del alelo mutado un 0,89%. La frecuencia genotípica de los portadores es inferior al 14,1% señalado por Shuster et al. (1992) para EE.UU. La diferencia puede deberse a que la frecuencia alélica observada en el sur de Chile involucra sólo una pequeña parte de los reproductores machos usados en Chile, aquellos provenientes de criaderos e inscritos en los registros genealógicos, y no a la masa total de reproductores usados en ambas regiones, ya que no puede descartarse absolutamente que se haya podido producir una mutación del gen CD18 en alguno de los reproductores nacionales usados en algún momento. Por otra parte, la introducción de la raza Holstein en el sur de Chile es muy posterior a la de la aparición de la mutación en EE.UU., por lo cual el gen no tuvo igual cantidad de tiempo para difundirse antes de que se conociera la enfermedad. En atención a que la raza Holstein existe en la zona central de Chile desde el siglo pasado, y como raza posee registros genealógicos desde 1946, es posible suponer que la frecuencia génica y de portadores puede ser mucho mayor en la zona central de Chile que en la IX y X Región.

La razón por la cual no se encontraron toros portadores del gen en el Criadero Carillanca se debe a la selección realizada contra la posible presencia del alelo recesivo en vacas madres de futuros toros. Sin embargo, el hecho de haberse vendido en Chile semen de toros portadores de BLAD, antes de que fuera conocida su condición de tal, determina que el alelo mutado esté presente en la población bovina del país, aunque su frecuencia aparentemente es baja, al menos en la IX y X Región. Actualmente es posible encontrar en catálogos de inseminación semen de toros portadores de BLAD, los cuales están relacionados con un ancestro común, el toro Osborndale Ivanhoe, nacido en 1952. Ello se debe a que este toro y toros portadores posteriores, han sido todos de alto mérito genético, por lo cual pueden ser interesantes para cruzamientos específicos, cuando se conoce la condición genética de las hembras a inseminar. En Chile se prohibió el ingreso de semen de toros portadores, no obstante es importante tipificar para el gen del BLAD aquellos reproductores de origen nacional, con el fin que la frecuencia génica disminuya en la población bovina. De ahí la importancia de disponer en Chile de las técnicas moleculares para identificar esta enfermedad.

CONCLUSIONES

La utilización de pruebas de ADN en base a la técnica descrita, es efectiva para identificar individuos portadores heterozigotos y animales enfermos homozigotos para la deficiencia de adhesión leucocitaria bovina (BLAD). Si bien la frecuencia del alelo es aparentemente baja, la aplicación de esta metodología adquiere real importancia, especialmente en la determinación de aquellos individuos portadores antes de que ingresen a un programa de inseminación artificial, y permite además diagnosticar y confirmar a aquellos individuos que presentan una sintomatología clínica que pudiera hacer sospechar la presencia de esta enfermedad.

LITERATURA CITADA

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