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PRESENCIA E INCIDENCIA DE VIRUS DE LA VID EN LA ZONA CENTRAL DE CHILE1 Presence and incidence of grapevine viruses in the central zone of Chile Guido Herrera M.2 y Mónica Madariaga V. 2 1 Recepción
originales: 7 de julio de 2000. Code Number: at01041 ABSTRACT In growing seasons from 1996 to 2000,
surveys were conducted in order to determine the incidence of Grape Fan Leaf
Virus (GFLV), Grape Leaf Roll Virus (GLRV), Tomato Ringspot Virus (ToRSV) y
Cherry Leaf Roll Virus (CLRV) in production and propagation material of grapevines.
A total of 16974 samples from 33 localities were studied. In all sites, samples
were collected from every 10th row, and on each row from every 10th plant. All
samples were tested by ELISA using antisera of the indicated viruses. The results
showed viral infection in 84.8% of the sites. The total incidence of GFLV was
0.2%, GLRV 0.6%, ToRSV 8.6% and CLRV 0.2%. However, variation was observed in
viral incidence within sites ranging between 0 and 72.6%. The incidence of viral
infection in mother material for propagation was 22.1%. It is concluded that
the ToRSV is the most prevalent virus in Central Chile.
Key words: grapevine, grape,
Vitis vinifera, virus, RESUMEN Entre las temporadas de cultivo 1996
y 2000 se realizó una prospección con el propósito de establecer
la incidencia de Grape Fan Leaf virus (GFLV), Grape Leaf Roll Virus (GLRV),
Tomato Ringspot Virus (ToRSV) y Cherry Leaf Roll Virus (CLRV) en vides (Vitis
vinifera L.), tanto en producción como en material madre para propagación.
Se analizaron 16.974 muestras provenientes de 33 localidades. En cada predio
se colectaron muestras siguiendo el siguiente esquema: en forma correlativa
se tomó la décima hilera y dentro de la hilera se colectaron muestras,
sucesivamente, de la décima planta. Todas las muestras se analizaron
para cada uno de los virus indicados mediante la prueba ELISA empleando sueros
policlonales (SANOFI, Francia). Los resultados mostraron que el 84,8 % de los
predios presentan infección virosa. Del total de muestras colectadas
GFLV mostró una incidencia de 0,2%, GLRV 0,6%, ToRSV 8,6% y CLRV 0,2%.
La incidencia de los distintos virus en cada predio en particular fue variable,
fluctuando entre 0% y 72,6%. Los resultados de la incidencia virosa en material
madre para propagación fue de 22,1%. Se concluye que el virus de mayor
incidencia en vides en la zona central de Chile es ToRSV. Palabras claves: viñas,
uvas, Vitis vinifera, virus. INTRODUCCIÓN El cultivo de la vid (Vitis vinifera
L.) en Chile se extiende desde Copiapó hasta Temuco, concentrándose
entre la V y VII regiones, reuniendo 43.000 ha de uva de mesa y 56.000 ha de
vides para vino. En términos totales, Chile exporta 1.326.000 t de fruta
fresca, de las cuales 36% corresponde a uva de mesa, generando un retorno de
US$ 504 millones (ODEPA, 1998). Considerando los mercados
internacionales, Chile ocupa el primer lugar entre los exportadores de uva de
mesa en el hemisferio sur, y el segundo a nivel mundial, siendo los principales
destinos EE.UU, Holanda y Reino Unido. Por otro lado, las empresas vitivinícolas
nacionales exportan el 40% de la producción nacional de vinos, niveles
que alcanzaron a US$ 233 millones en 1996. Los vinos chilenos constituyen el
3% del total de vinos comercializados a nivel mundial. En consecuencia el negocio
del cultivo de la vid significa una entrada anual de más de US$ 700 millones
para nuestro país. Dentro de los factores productivos
que afectan la calidad de la fruta están los diferentes patógenos
que atacan el cultivo de la vid. Uno de los problemas fitopatológicos
de mayor incidencia, a nivel mundial, y que afecta al desarrollo de las plantas
y la calidad de la producción son las enfermedades causadas por virus.
En el cultivo de la vid, a nivel mundial se han identificado 44 virus diferentes,
pertenecientes a 5 familias y 16 géneros (Martelli y Walter,
1998). Sin embargo, sólo algunos de ellos tienen importancia en las
distintas regiones donde se cultivan las vides. Los virus Nepovirus son los más
diseminados, y en Europa son denominados degenerativos: Grape Fan Leaf Virus
(GFLV), Arabis Mosaic Virus (ArMV), Tobacco Black Ring Virus (TBRV), Strawberry
Latent Ringspot Virus (SLRV), Raspberry Ringspot Virus (RRV), mientras que en
EE.UU. y Canadá son referidos como causantes de declinamiento: Tomato
Ringspot Virus (TomRSV), Raspberry Ringspot Virus (RRV), Tobacco Ringspot Virus
(TBRSV) y Blueberry Leaf Mottle Virus (BBLMV) (Goheen, 1977;
Martelli, 1993). Otro grupo de importancia, lo constituyen los Closterovirus,
cuyo principal representante en vides es Grapevine Leaf Roll Virus (GLRV). Este
incluye a 7 virus serológicamente distintos, algunos transmitidos por
insectos (Martelli y Walter, 1998). Las primeras observaciones de síntomas
de virus en Chile fueron hechas y reportadas por Hewitt (1965),
posteriormente Volosky (1967) transmitió un virus
no identificado hospedero herbáceo. En 1979, Cereceda
y Auger (1979) identificaron como GFLV a un virus causante de amarillez
foliar en el cv. Semillón, y posteriormente Auger et
al. (1994) estudiaron los efectos del virus en el desarrollo y productividad
de las plantas afectadas. En la actualidad, se considera que las principales
enfermedades causadas por virus a nivel mundial están presentes en Chile.
Así, se han reportado GFLV (Auger et al., 1994),
GLRV (Arancibia, 1988; Sanchez y Hepp,
1994), TomRSV (Herrera y Madariaga, 1994), ArMV y Cherry
Leaf Roll Virus (CLRV) (Sanchez y Hepp, 1994; Sánchez,
1995; Herrera, 1996;). El objetivo de la presente investigación
fue establecer la incidencia de los virus GFLV, GLRV, TomRSV y CLRV en vides
en producción y en viveros en la zona central de Chile. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se realizó en 33
predios con vides en producción, y en 6 viveros con plantas madres y
material de propagación, ubicados en la V, VI y Región Metropolitana,
entre los meses de septiembre y enero de las temporadas 1996 a 2000. En cada
predio se colectaron muestras al azar, según el siguiente esquema: en
cada décima hilera de plantas se colectaron sucesivamente muestras de
cada décima planta. La muestra estuvo constituida por material verde
(hojas y brotes) de una sola planta, la cual se identificó adecuadamente,
se colocó en bolsa plástica y se almacenó en una caja de
plástico a temperatura regulada (inferior a 20°C) para ser llevadas para
análisis al laboratorio de virología del Centro Regional de Investigación
La Platina, perteneciente al Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA),
ubicado en Santiago. El número de muestras por
campo fue variable, dependiendo de su tamaño. Generalmente, se tendió
a colectar aproximadamente el 10% del total de plantas. Todas las muestras se
analizaron serológicamente según el procedimiento ELISA indirecto,
utilizando antisueros para los siguientes virus; GFLV, GLRV, TomRSV y CLRV (SANOFI,
Francia). Asimismo, en los predios visitados se colectaron muestras de plantas
con síntomas atribuibles a una virosis, las que fueron procesadas en
forma similar a las anteriores. Cuando los cuatro virus prospectados dieron
resultados negativos, las mismas muestras se sometieron a una batería
de antisueros que incluyeron a los siguientes virus reportados por Martelli
(1993) como presentes en vides en diferentes localidades del mundo: Alfalfa
Mosaic Virus (AMV) (Bercks et al., 1973), Apple
Mosaic Virus (ApMV), Arabis Mosaic Virus (ArMV), Carnation Mottle Virus (CarMV),
Cucumber Mosaic Virus (CMV), Potato Virus X (PVX), Tomato Black Ring Virus (TBRV),
Tobacco Streak Virus (TSV), Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) (Stobbs
y Broadbent, 1993), Raspberry Ringspot Virus (RRV), Strawberry Latent Ringspot
Virus (SLRV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) y Tobacco Ringspot Virus (TRSV). Además,
las muestras se estudiaron serológicamente por ELISA con antisueros policlonales
específicos para la detección de la bacteria Xillela fastidiosa,
agente causal de la enfermedad de Pierce, ausente aún en los viñedos
chilenos. La ejecución de la prueba
ELISA se realizó de la siguiente manera: con un rodillo manual se trituró
aproximadamente 1 g de hojas y brotes nuevos, se diluyó (1/10 p/v) en
tampón de extracción (Na2CO3 1,5 mM, NaHCO3
3,5 mM, pH 9,6). Luego, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min.
En placas de poliestireno se adicionaron 100 m uL del sobrenadante por
muestra (antígeno) a cada celda, incluyendo siempre una repetición
(dos celdas), incubándose la placa bajo condiciones de refrigeración,
toda la noche. Enseguida, las placas se lavaron con solución de lavado
PBST (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM NaHPO4x12H20
8,09 mM, KCl 2,68 mM y 0,05 % Tween-20) cinco veces, cada vez durante 5 min.
Luego, se adicionó solución de bloqueo albúmina de huevo
al 3% en PBS 1X (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4x12H2O
8,09 mM, KCl 2,68 mM) incubándose durante 2 h a 37 ºC. Después
de un lavado similar a los anteriores, se agregaron las inmunoglobulinas policlonales
diluidas en tampón conjugado (albúmina de bovino 0,2%, PVP-40
0,5 M en PBS 1X), incubándose durante 3 h a 37 ºC. Posteriormente, después
de lavar se les incorporó el segundo anticuerpo producido en cabra conjugado
con la enzima fosfatasa alcalina, incubándose las placas durante toda
la noche a 4ºC. Finalmente, la reacción se reveló adicionando
1 mg mL-1 de p-nitrofenilfosfato en tampón dietanolamina (9,7%
v/v). Las reacciones inmunológicas se evaluaron en un lector ELISA (modelo
EL 312e, marca Bio Kinetic, USA), considerando como muestras positivas, todas
aquellas superiores al doble del valor de absorbancia de los controles sanos. RESULTADOS Considerando vides en producción,
los resultados indicaron que en los 33 predios prospectados con un total de
16974 muestras, se encontró una infección virosa promedio de 9,8%
(Cuadro 1). Sólo 5 de los 33 campos estudiados no presentaron
presencia de ninguno de los 4 virus analizados, constituyendo el 15,1%. Otros
21 predios mostraron infecciones totales inferiores a 10% y en 7 campos las
infecciones fluctuaron de entre 11 y 72%. Los virus que se encontraron con mayor
frecuencia, en términos de predios infectados, fueron TomRSV y GLRV con
45,4 y 63,6%, respectivamente. En niveles inferiores se presentaron GFLV y CLRV
con 30,3 y 27,2%, respectivamente.
1 Grape
Fan Leaf Virus Un análisis individual de cada uno de
los virus, en relación al número total de muestras colectadas,
indicó que el virus de mayor incidencia fue TomRSV con un 8,7%. El
resto de los virus no superó la barrera del 1%. Sin embargo, cuando
se analizaron los resultados de cada uno de los virus en particular, dentro
de cada predio, los resultados fueron altamente variables. En algunos campos,
los niveles de incidencia, tanto de GLRV como de TomRSV, alcanzaron el 20
ó 63% de plantas infectadas. Considerando las prospecciones de virus en material madre para propagación, que incluyeron 6 viveros con un total de 7963 muestras, mostraron una incidencia promedio de infección virosa de 22,1% (Cuadro 2). Particularmente, en cada vivero los niveles de incidencia fueron relativamente altos. Por ejemplo, viveros ubicados en la VI Región presentaron infecciones del orden del 25% en el material madre, llegando en un caso al 42,2%. El análisis individual de cada virus mostró que el virus prevalente en los viveros fue TomRSV. Este virus mostró infecciones promedios para todos los viveros de 14,4%, con un rango variable entre 0 y 30,7%. Otro virus encontrado en niveles importantes fue GLRV, con una incidencia de 7,5% y un rango de 2,0 a 21,4%. Con menor incidencia se determinaron a GFLV y CLRV (Cuadro 2). Cuadro 2..
Incidencia (%) de los virus GFLV1, GLRV2,
TomRSV3 y CLRV4 en
viveros de vides en la zona central de Chile.
1
Grape Fan Leaf Virus. En los distintos predios visitados se encontraron, en forma esporádica, plantas con destacada disminución de crecimiento, manchas cloróticas en las hojas, mosaico leve en la lámina de las hojas, malformación de sarmientos y/u hojas, diferencias en brotación dentro del sarmiento, etc. Muestras de estas plantas, que fueron negativas a reacciones con antisueros de los 4 virus utilizados en los estudios de incidencia (14 muestras), se sometieron a prueba ELISA con otros antisueros de virus detectados en vides en diferentes partes del mundo. Así, en el Cuadro 3 se indican las diferentes reacciones para estos antisueros. Se obtuvieron reacciones positivas para los siguientes virus; ArMV, RRV, SLRV, PVX, TSWV, TSV y TBRV. Por otro lado, todas las reacciones fueron negativas para los virus AMV, ApMV, CarMV, CMV, TMV, ToRSV y GFV. También los resultados fueron negativos contra antisuero para la bacteria Xilella fastidiosa.. Cuadro 3.
Reacción ELISA a antisueros de virus reportados en vides de muestras
de vides con síntomas virosos provenientes de diferentes localidades.
DISCUSIÓN Se han identificado a nivel mundial, 44 virus pertenecientes a 5 familias y 16 géneros en el cultivo de la vid (Martelli, 1994). En Chile, la mayoría del material de propagación disponible para la venta, tanto para uva de mesa como vides para vinificación, se caracterizan por ser plantas calificadas como corrientes. Esto significa que los diferentes viveros sólo pueden acreditar que el material es obtenido de plantas madres vigorosas y aparentemente libres de enfermedades sobre la base de una inspección visual. No existen entidades públicas o privadas que tengan sistemas de certificación de plantas o sistemas intermedios que aseguren la ausencia de virus. La consecuencia de esta situación se ha visto reflejada en otros estudios, así por ejemplo, Herrera y Madariaga (1994) indicaron infecciones de 16 y 22% en parronales de la zona central para los virus GFLV y GLRV, respectivamente. El presente estudio en viñas y/o parronales de las regiones V, Región Metropolitana y VI, y que incluyó 16.974 muestras tomadas al azar, indica infecciones promedios de 9,8%. No obstante, se observó una heterogeneidad en la incidencia de los virus en los distintos predios estudiados. Esta heterogeneidad sugiere que, en aquellos predios sin infección virosa, el material de propagación provino de plantas madres sin estos virus, contrastando con los predios de elevada infección, donde probablemente el material provino de plantas madres infectadas. Más preocupante es la situación de viveros de producción de plantas de vides, en los cuales los promedios de infección llegaron al 22,1%. Cabe destacar, que de acuerdo a los resultados expuestos, se observa una predominancia de la incidencia de TomRSV en relación a los otros virus estudiados. TomRSV se presenta en el Este de EE.UU. y Canadá, siendo de muy baja incidencia en California (Gonzalves, 1988). Estos resultados confirman la detección del virus en Chile por Herrera y Madariaga (1994) y Herrera (1996), y sugieren que en ciertas localidades podría constituirse en un factor detrimental de los rendimientos. Se indica a TomRSV como el causante del declinamiento progresivo de la vid. En los primeros años, los síntomas pasan inadvertidos, excepto por heterogeneidad en la brotación, especialmente en las regiones más frías. Posteriormente, las plantas infectadas muestran acortamiento de entrenudos, hojas pequeñas, deformadas y disminuciones de crecimiento. Bajo las condiciones de comercialización de plantas de vides en Chile, en que predomina la venta de plantas corrientes, y las características de este grupo de virus (transmisión por nemátodos y material de propagación), en el futuro podrían constituirse en un serio problema para el cultivo de la vid en Chile. La presente investigación también demostró que los cultivos de vides en Chile, no sólo están afectados por las enfermedades más comunes a nivel mundial, sino también por otros virus que se presentan en este cultivo. Así se detectó la presencia de ArMV, PVX, TomBRV, RRV, SLRV, TSV y TSWV. De estos virus, PVX y TSWV son patógenos importantes en otros cultivos, pero en la vid tienen importancia secundaria. Los resultados expuestos en la presente investigación permiten dimensionar la situación virológica de la vid en Chile. Los virus más importantes de la vid en el mundo están presentes en nuestras condiciones, con mayor o menor incidencia, dependiendo principalmente del origen del material propagado. Esto se ve reflejado en los resultados de la incidencia virosa en viveros; se observó una variación entre viveros y, dentro del vivero, entre diferentes virus. Probablemente, las plantas de vides en producción con baja incidencia virosa provienen de viveros poco infectados, y viceversa. Aunque mayores y más detalladas investigaciones son necesarias, los resultados expuestos proveen de información necesaria para enfatizar el establecimiento de programas integrados de control de estas enfermedades. CONCLUSIONES La incidencia promedio de infección virosa en plantaciones de vides en producción, en un total de 16.974 muestras, fue de 9,8%. En plantas madres para propagación se encontró un 22,1% en un total de 7.963 muestras.. En los diferentes predios fluctuó entre 0 y 72%. En 16.974 muestras colectadas en plantaciones de vides en producción, se determinó una incidencia de 0,2% para GFLV, 0,66% para GLRV, 8,6% para TomRSV y 0,28% para CLRV. En 7.963 muestras colectadas en viveros de vides se determinó una incidencia de 0,2% para GFLV, 7,5% para GLRV, 14,4% para TomRSV y 0,1% para CLRV. El virus de mayor incidencia, tanto en plantaciones de vides en producción como en material madre para propagación, fue TomRSV. Se detectaron mediante ELISA los siguientes virus de importancia secundaria en el cultivo de la vid; ArMV, RRV, SLRV, PVX, TSWV, TSV y TBRV. No se detectó la presencia de X. fastidiosa. LITERATURA CITADA
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