Agricultura Técnica Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA ISSN: 0365-2807 EISSN: 0717-6333 Vol. 63, Num. 2, 2003, pp. 169-179

Agricultura Técnica, Vol. 63, No. 2, April-June, 2003, pp. 169-179

ESTIMACIÓN DE LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN LEGUMINOSAS FORRAJERAS MEDIANTE LA METODOLOGÍA DEL ¹⁵N.

Estimation of biological nitrogen fixation in forage legumes using a ¹⁵N labeling methodology.

Ricardo Campillo R.*, Segundo Urquiaga C., Inés Pino N.  y Adolfo Montenegro B.²

¹ Recepción de originales: 18 de octubre de 2001.
Trabajo presentado en el VII Congreso Nacional de la Ciencia del Suelo, Temuco, Chile, 10-13 mayo 1995.
²Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile. E-mail: rcampill@carillanca.inia.cl; *: Autor para correspondencia. amontene@carillanca.inia.cl
³Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiología, Seropédica, Brasil. E-mail: urquiaga@cnpab.embrapa.br
⁴Comisión Chilena de Energía Nuclear, Casilla 188-D. Santiago, Chile. E-mail: ipino@cchen.cl

Code Number: at03018

ABSTRACT

The contribution of biological nitrogen N₂  fixation (FBN) in four forage legumes: white clover (Trifolium repens L.), red clover (Trifolium pratense L.), subterranean clover (Trifolium subterraneum L.) and alfalfa (Medicago sativa L.), with and without specific rhizobium inoculation, was evaluated by the A value isotope technique, using  three grasses: oats (Avena sativa L.), perennial ryegrass (Lolium perenne L.) and fescue  (Festuca arundinacea Schreb.) as reference crops. The study was carried out for three years on an andisol (Typic fulvudand), at the Carillanca Regional Research Center of de National Agricultural Research Institute, IX Region, Chile. The dose of N applied was 10 kg N ha^-1   using ammonium sulfate (10 atom % ¹⁵N excess) for legume species, and 30 kg ha^-1  as ammonium sulfate (5 atom % ¹⁵N excess) for grass species. Plant samples were analyzed for total N (Kjeldahl) and atom % ¹⁵N excess (optical emission spectrometry). All the three reference crops showed similar values of FBN to the legumes. The FBN capacity reached 90% in all seasons and by all the legumes. No significant influence of inoculation with rhizobium was found, except for alfalfa and only in the first season. The quantity of N fixed in all seasons was high and for all the legumes,  ranging from 60 to 770 kg ha^-1  year^-1, for subterranean clover and alfalfa, respectively, confirming  the great efficiency of the FBN mechanism on the forage legumes under study.

Key words: forage legumes, inoculation, nitrogen, isotopic techniques.

RESUMEN

Se  estudió la contribución de la fijación biológica de N₂  (FBN) en cuatro leguminosas forrajeras, trébol blanco (Trifolium repens L.), trébol rosado (Trifolium pratense L.), trébol subterráneo (Trifolium subterraneum  L.) y alfalfa (Medicago sativa L.), con  y  sin  inoculación  específica de rhizobio, mediante la metodología  isotópica del Valor A, empleando  tres gramíneas, avena (Avena sativa L.), ballica perenne (Lolium perenne L.) y festuca (Festuca arundinacea Schreb.) como cultivos de referencia.  El estudio se llevó a cabo en un andisol (Typic fulvudand), en el Centro Regional de Investigación Carillanca, del Instituto de Investigaciones Agropecuarias, IX Región, Chile, durante tres temporadas. Las dosis aplicadas de N correspondieron a 10 kg ha^-1  como sulfato de amonio (10% átomos exceso ¹⁵N) para las especies leguminosas y de 30 kg ha^-1  como sulfato de amonio (5% átomos exceso ¹⁵N) para las gramíneas de referencia. En las muestras de material vegetal se analizó N total (Kjeldahl) y ¹⁵N (espectrometría de emisión óptica). Los tres cultivos de referencia mostraron estimaciones similares de la FBN en las leguminosas. La capacidad de FBN alcanzó el 90% en todas las temporadas y para todas las leguminosas. No se encontró efecto significativo respecto a la inoculación con rhizobium, excepto en alfalfa y sólo en la primera temporada. La cantidad de N fijado en todas las temporadas fue alta y con todas las leguminosas, variando entre 60 y 770 kg ha^-1  año^-1, para trébol subterráneo y alfalfa, respectivamente, ratificando la gran eficiencia del mecanismo de FBN en las leguminosas forrajeras en estudio.

Palabras claves: leguminosas forrajeras, inoculación, nitrógeno, técnicas isotópicas.

INTRODUCCIÓN

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) en las leguminosas contribuye significativamente a la nutrición nitrogenada y productividad de las praderas.  Por ello, es esencial implementar metodologías apropiadas para su evaluación. En la medición de la FBN de especies leguminosas  se han utilizado diferentes metodologías, tales como diferencias en la acumulación de N total o el rendimiento de MS entre plantas fijadoras y no fijadoras (Vincent, 1982; Hardarson et al., 1984). La técnica de reducción del acetileno (Hardy et al., 1968), que ha probado ser  útil para detectar sistemas de fijación de N, también tiene limitaciones debido a que mide la actividad de la enzima nitrogenasa de manera puntual y en un corto período de tiempo.

Las técnicas isotópicas del ¹⁵N se consideran como las únicas que ofrecen cuantificaciones globales de la FBN, que permiten distinguir la proporción de N en la planta que procede del suelo, de un fertilizante o de la atmósfera, y entregan valores de FBN integrados para todo un ciclo de crecimiento de un sistema leguminosa - rhizobium dado (Barea, 1991; Danso, 1995).

En la IX Región de Chile existe una amplia superficie de suelos derivados de cenizas volcánicas recientes conocidos como trumaos (andisoles) y de cenizas volcánicas antiguas denominados rojo arcillosos (ultisoles).  Se ha establecido también que estos suelos presentan particularidades químicas, tales como alta retención y baja disponibilidad de P, bajos contenidos de bases principalmente de Ca, asociados a niveles tóxicos de Al de intercambio y pH, que están  afectando la productividad de cultivos y praderas (Campillo, 1994).

A pesar de la importancia de las leguminosas en la producción  de las praderas y en la economía del N de los sistemas pratenses, no existe información nacional precisa sobre la real capacidad de fijación de N de estas especies leguminosas.  La información disponible en la actualidad es escasa, contradictoria  y obtenida principalmente en forma indirecta (método de la diferencia y reducción de acetileno). Este conocimiento, así como el impacto que provoca el uso de enmiendas calcáreas y la fertilización fosforada en la FBN de las leguminosas forrajeras, es básico para conseguir el objetivo central de lograr una eficiente fijación de N y ahorro de fertilizante nitrogenado en los ecosistemas pratenses del sur de Chile.

En Chile en general, y en la IX y X regiones en particular, existen escasos antecedentes de estimaciones  de la FBN que muestren la magnitud y estacionalidad del proceso en las leguminosas de la zona, principalmente de trébol rosado (Trifolium pratense L.), trébol subterráneo (Trifolium subterraneum L.) y alfalfa (Medicago sativa L.).   Urzúa et al.  (1985) observaron mediante el método de la reducción del acetileno que en la X Región el aporte de la FBN al trébol blanco en mezcla con ballica perenne (Lolium perenne L.) era de 78 kg N ha^-1  año^-1. Sin embargo, también se ha informado de valores promedio de 56 kg N ha^-1  año^-1  en praderas permanentes de la provincia de Osorno (costa, llano longitudinal y precordillera andina), usando esta misma técnica (Urzúa et al., 1987). Teuber  (1996) usando el método de reducción de acetileno, observó valores de 97 kg N ha^-1  año^-1como potencial  de FBN para la pradera mejorada del llano central de la X Región. Cabe recordar que estas estimaciones distan bastante de las obtenidas en otras latitudes como Nueva Zelanda, donde el aporte de N por la fijación simbiótica en praderas permanentes de trébol blanco con ballica perenne fluctúa entre 100 y 300 kg N ha^-1  año^-1  (Ball, 1982).

  El objetivo de este estudio fue cuantificar la FBN en cuatro leguminosas forrajeras utilizadas en el sur de Chile, mediante la metodología del ¹⁵N (Valor A), y su variación por efecto de la inoculación con rhyzobium. Adicionalmente, se evaluó la factibilidad de uso de tres especies gramíneas como cultivos de referencia para la estimación del proceso de FBN de estas leguminosas.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Centro Regional de Investigación Carillanca, perteneciente al Instituto de Investigaciones Agropecuaria (INIA), comuna de Vilcún (38º41' lat.  Sur, 72º25' long.  Oeste, 200 m.s.n.m.), cercana a la ciudad de Temuco, IX Región, durante tres temporadas (1990-1992). El suelo corresponde a un andisol de la serie Vilcún (Typic Fulvudand) y presentaba en los primeros 7,5 cm: 29 mg kg^-1  de P Olsen;  13% MO; 9 cmol+  kg^-1  de suma de bases de intercambio y ausencia de limitaciones de acidez (pH H₂O 6,2 y 0,01% de saturación de Al). Estos niveles se presentaban con escasa variación hasta los 15 cm de profundidad. Las buenas condiciones de fertilidad inicial del sitio se explican por corresponder a un suelo con rotación intensiva de cultivos anuales (raps, trigo, avena, cebada), por más de 25 años.

El diseño utilizado fue de bloques completos al azar, con cuatro repeticiones. Los tratamientos consideraron las combinaciones factoriales de cuatro leguminosas y ausencia y aplicación de inóculo y las tres especies de gramíneas, en parcelas de 2 x 6 m. Se evaluaron cuatro especies leguminosas: trébol blanco (Trifolium repens L.) var. Huía; trébol rosado var. Quiñequeli; trébol subterráneo var.  Mount Barker; y alfalfa var.  Criolla, con y sin inoculante comercial específico. Se utilizaron los inoculantes comerciales Rhizobium trifolii para tréboles y Rhizobium meliloti para alfalfa (NITROFIX, Concepción, Chile), empleando 10 g de inoculante por kilogramo de semilla y goma arábiga como adherente, junto con el fungicida metalaxil (Apron, CIBA-GEIGY S.A.).  Las semillas inoculadas y desinfectadas fueron peletizadas con 500 g de carbonato de calcio por kilogramo de semilla.  Además, se evaluaron tres especies de gramíneas como cultivos de referencia:  avena  (Avena sativa L.) var. Nehuén; ballica perenne var. Nui y festuca (Fastuca arundinacea Schreb.) var. Fawn.

El experimento se sembró en la  segunda quincena de marzo con una  máquina sembradora manual (Planet Junior), a 20 cm entre hileras. Las dosis de semilla fueron 4 kg ha^-1  de trébol blanco, 12 kg ha^-1  de trébol rosado, 10 kg ha^-1  de trébol subterráneo, 20 kg ha^-1  de alfalfa, 120 kg ha^-1  de avena y 15 kg ha^-1  de ballica perenne y festuca. Inicialmente se aplicó una fertilización base de 50 kg ha^-1  de P (superfosfato triple) y 125 kg ha^-1  de K (sulfato de potasio). En marzo de las temporadas siguientes se refertilizó de mantención con estas mismas dosis, complementándose con 125 kg ha^-1  de K (muriato de potasio) en octubre y 70 kg ha^-1de K y S y  60 kg ha^-1  de Mg (Sulpomag) en diciembre de cada año. El experimento fue regado en forma gravitacional desde diciembre a marzo de cada temporada, reponiéndose el 100% de la evaporación de bandeja cada 10 días. La producción de MS se evaluó en la macroparcela de producción, cosechándose 4 m²  a través de cortes con una máquina segadora de barra autopropulsada. Las muestras de forraje verde se secaron en horno con ventilación forzada de aire a 65ºC hasta alcanzar peso constante, para detersu contenido de MS. En la primera temporada se hicieron cuatro cortes, mientras que durante la segunda  y tercera temporada se obtuvieron cinco cortes.

Evaluación de la fijación de N₂  con la técnica isotópica del  ¹⁵N
En microparcelas de 1 m², localizadas dentro de la macroparcela,    se aplicaron dosis de N de 10 kg ha^-1  como sulfato de amonio (10% atomos exceso (a.e.)  ¹⁵N) para las especies leguminosas y de 30 kg ha^-1   como sulfato de amonio (5% a.e. ¹⁵N) para las gramíneas de referencia (Labandera et al., 1988; Hardarson y Danso, 1990). El fertilizante marcado fue aplicado en solución en la microparcela cada dos cortes. La microparcela fue desplazada dentro de la macroparcela cada dos cortes, para seguir la secuencia de marcación.  El resto de la macroparcela recibió la misma dosis de fertilizante, pero sin ¹⁵N.  En cada corte se colectó un área de 0,9 x 0,9 m dentro de la microparcela.  Las muestras de forraje verde de cada especie, por separado, se secaron en horno con ventilación forzada de aire a 65ºC hasta alcanzar peso constante, para detersu contenido de MS. En una submuestra de material vegetal se analizó N total (Kjeldahl) y la relación isotópica ¹⁵N ¹⁴N^-1  (espectrometría de emisión óptica, NOI-6, Leipzig, Alemania). Para el cálculo del N fijado por las leguminosas solas, se utilizó la metodología del valor A (Hardarson y Danso, 1990; Danso, 1995). Los datos obtenidos fueron sometidos a ANDEVA y cuando hubo diferencias significativas se utilizó la prueba de contrastes ortogonales para comparación de las medias de tratamiento, usando el programa estadístico SAS version 6.12 (SAS, 1989). La alfalfa se estableció en primavera por ser la época de siembra  más recomendable. Ello determinó que en la primera temporada sólo hubo dos cortes para las evaluaciones, de los cuales únicamente se marcó con ¹⁵N el segundo corte.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al final de la primera temporada la práctica de inoculación de las semillas de leguminosas con rhizobio específico no mostró efectos significativos en las producciones acumuladas de MS de trébol blanco, trébol subterráneo y trébol rosado, pero sí tuvo efecto (P < 0,01) en la alfalfa (Cuadro 1). En las temporadas posteriores tampoco hubo efecto de la inoculación  en ninguna de las leguminosas. Ello indicaría que el suelo presentaba inicialmente una población adecuada de rhizobio para estas especies, a excepción de la alfalfa, situación que posteriormente se revirtió, una vez que la cepa inoculada alcanzó predominancia en el suelo.

Un factor fundamental en la aplicación exitosa de las técnicas isotópicas con ¹⁵N para  estimar la capacidad de FBN de las leguminosas, es la elección del cultivo de referencia (Danso et al., 1993; Danso, 1995). Para resolver esta interrogante, durante la primera temporada se evaluaron tres especies gramíneas que normalmente se siembran en la región. Al comparar la FBN (%) de las leguminosas basado en el uso de las tres especies gramíneas como referencia (Cuadro 2), se observó una gran similitud en los valores estimados, independientemente de la gramínea utilizada como referencia. Adicionalmente, los valores de fijación fueron elevados en todas las leguminosas, variando entre 80 y 95%, al margen de la inoculación. Es importante destacar que los valores de coeficiente de variación obtenidos en cada corte fueron muy pequeños y similares también para todas las gramíneas.

Cuando se estableció la comparación del manejo con o sin inoculación de las especies leguminosas, para la estimación de la FBN mediante contrastes ortogonales, se observó una respuesta similar entre los tres cultivos de referencia utilizados (Cuadros 2 y 3). Con los tres cultivos de referencia se detectó efecto significativo (P < 0,01) de la inoculación solamente para trébol subterráneo, situación que en las temporadas siguientes desapareció. Con  las  otras  leguminosas  no  hubo  efecto de la inoculación  sobre  la FBN. Está ampliamente establecido que la selección del cultivo de referencia es menos crítica en la medición de la  FBN en cultivos altamente fijadores (Hardarson y Danso, 1990; Danso et al., 1993). De acuerdo a estos resultados, se decidió utilizar ballica perenne como cultivo de referencia para la estimación de la FBN, puesto que su ciclo de desarrollo y producción se asemeja más al de las leguminosas estudiadas en este experimento. Adicionalmente, la literatura señala ampliamente a esta especie como un cultivo de referencia  adecuado para estas especies leguminosas (Labandera et al., 1988; Hardarson et al.,  1988; Hardarson y Danso, 1990).

En las siguientes temporadas los índices de FBN (%) se mantuvieron elevados, confirmando así la alta eficiencia de operación del mecanismo biológico en las condiciones del experimento (Cuadros 4 y 5). Durante la tercera y última temporada de evaluación se observaron algunos efectos significativos (P < 0,05) del manejo de la inoculación, principalmente en el tercer corte (Cuadro 5). Sin embargo, no fue posible establecer aquí un patrón coherente de respuesta. Es importante recordar que esta situación se expresó en la tercera temporada de evaluación de las parcelas, cuando el trébol rosado presentaba una declinación natural en su población de plantas. También pudo haber influido la variación en la cobertura del suelo alcanzada por las leguminosas al momento del muestreo.

El N fijado (kg ha^-1) por las distintas leguminosas a lo largo de las tres temporadas se desglosa en el Cuadro 6. Con excepción de la primera temporada en trébol subterráneo y alfalfa, no hubo efecto de la inoculación en este índice de FBN, lo cual confirma los resultados de porcentajes de FBN. En el caso de trébol subterráneo (dos cortes acumulados), el mejor comportamiento sin inoculación es difícil de explicar con los datos disponibles; sin embargo, este efecto desapareció en las dos temporadas siguientes. Respecto a la alfalfa (un solo corte marcado), es importante recordar que el sitio experimental provenía de un sistema de rotación intensiva de cultivos anuales e históricamente no registraba siembras de alfalfa, razón por la cual el suelo no presentaba infección natural con cepas de rhizobio específicas para esta leguminosa. Ello explicaría el efecto inicial de la inoculación en la primera temporada.

Estos resultados ilustran la gran eficiencia del mecanismo de FBN en todas estas especies leguminosas. El trébol subterráneo, como especie anual de resiembra, presentó la mayor variabilidad de N fijado (60 a 191  kg N ha^-1  año^-1),  debido a su mayor dependencia de las condiciones climáticas de cada temporada (Cuadro 6). Resultados similares han sido encontrados en Australia respecto de trébol subterráneo en praderas mixtas, con valores de fijación entre 2 y 206  kg N ha^-1  año^-1 (Peoples et al., 1995).

El trébol rosado alcanzó su producción máxima durante la primera temporada (424 kg ha^-1), para declinar posteriormente en razón de sus limitaciones naturales de persistencia (Cuadro 6).   Heichel et al.  (1985) informaron que en Minnesota, EE.UU., la FBN de trébol rosado fluctuó entre 69 y 133  kg N ha^-1  año^-1, con una marcada declinación a partir del segundo año.

El trébol blanco expresó su mayor potencial de fijación de N a partir de la segunda temporada donde alcanzó los 396  kg ha^-1, valores equivalentes o superiores a aquellos reportados en Nueva Zelanda (Ball, 1982) y Gran Bretaña (Rennie, 1986; Marriot y Haystead, 1993).  En andisoles regados de la IX Región, también mediante la técnica de dilución isotópica, se determinó que la FBN en trébol blanco de praderas permanentes fluctuó entre 218 y 272 kg N ha^-1  año^-1  (Campillo y Barrientos,  2000). Estas cifras ratifican la alta eficiencia que logra expresar este proceso biológico debido a la ausencia de limitaciones de fertilidad y riego.

Finalmente, la alfalfa incrementó sustancialmente sus índices de fijación de N, alcanzando los 770 kg ha^-1  al cabo de la tercera temporada. Estos valores son notoriamente superiores a mediciones realizadas en el extranjero.  Hardarson et al.  (1988), en Seibersdorf, Austria, indicaron que la alfalfa fijó hasta 378   kg N ha^-1  año^-1.   En  Minnesota, EE.UU., se encontró que durante el año de establecimiento la alfalfa fijó 160 a 177 kg N ha^-1  año^-1, mientras que en los años siguientes alcanzó una FBN de 224    kg N ha^-1  año^-1  (Heichel et al., 1984). Los  valores medidos en suelos de la IX Región demuestran el gran potencial de estas leguminosas forrajeras para acumular N en los ecosistemas ganaderos, mediante este eficiente mecanismo biológico, cuando se proporcionan las condiciones adecuadas de nutrición, riego y manejo.

Se deben destacar las diferencias que alcanzó el coeficiente de variación del N fijado (%) (Cuadros 4 y 5)  y N fijado (kg ha^-1) por las distintas leguminosas (Cuadro 6).  El N fijado (kg ha^-1) presentó mayor variabilidad en los coeficientes debido a que en su cálculo se consideran variables de producción, las cuales siempre presentan una mayor variación.  En cambio, el porcentaje de FBN es independiente de las variables de rendimiento, presentando por ello una escasa variación porcentual. Estos resultados son coincidentes con aquellos reportados por la literatura (Labandera et al., 1988;  Danso et al., 1993).

Respecto del total de N acumulado por las leguminosas en las tres temporadas (Cuadro 7), se repite la situación ya analizada para los índices de FBN, donde solamente el trébol subterráneo y la alfalfa (primera temporada)  mostraron efectos (P < 0,01) por el manejo de la inoculación. En este caso son válidas las mismas razones ya expuestas para los índices de FBN, puesto que cerca de 90% del total de N acumulado por las leguminosas proviene del aire. Cabe recordar que el N acumulado por las leguminosas durante la temporada proviene  fundamentalmente del mecanismo de FBN, del N-fertilizante utilizado para la marcación del suelo y del suministro de N que realiza el suelo en forma natural (Hardarson y Danso, 1990; Danso, 1995).  Destaca nuevamente la gran cantidad de N total acumulado en la biomasa de estas leguminosas. Las mayores acumulaciones de N total por especie en las distintas temporadas fueron: alfalfa  867 kg ha^-1; trébol rosado 471 kg ha^-1; trébol blanco 442 kg   ha^-1  y trébol subterráneo 204 kg ha^-1  (Cuadro 7).

CONCLUSIONES

Las buenas condiciones de fertilidad del suelo y el riego permitieron alcanzar altas producciones acumuladas de MS en las leguminosas estudiadas sin efectos por la inoculación, salvo con la alfalfa y sólo durante el primer año. Los tres cultivos de referencia mostraron estimaciones similares de la FBN de las leguminosas. No obstante, se optó por ballica perenne var. Nui, puesto que su ciclo de desarrollo y producción se asemeja más a las leguminosas estudiadas.

El porcentaje de FBN fue elevado en todas las temporadas y con todas las leguminosas, alcanzando 90% en promedio.  No se observó efecto (P < 0,05) de la inoculación sobre el porcentaje de FBN, salvo del trébol subterráneo en el primer año.  La FBN (kg ha^-1) fue alta en todas las temporadas y con todas las leguminosas, fluctuando entre 232 y 396 kg ha^-1  en el trébol blanco, 292 y 424 kg ha^-1  para trébol rosado, 60 a 191 kg ha^-1 en el trébol subterráneo, y entre 88 y 770 kg ha^-1  para alfalfa. Estos valores ratifican la gran eficiencia del mecanismo biológico de fijación de N con todas las leguminosas estudiadas. Los resultados anteriores indican que bajo las condiciones de suelo y clima del ensayo, la inoculación de las semillas no expresó mayor eficiencia respecto de  las cepas nativas presentes en el suelo.

RECONOCIMIENTOS

Se agradece el apoyo del Organismo Internacional de Energía Atómica en la realización de este proyecto (CHI 5/018), en especial al Dr. Felipe Zapata.  Asimismo, se agradece al Laboratorio Técnicas Nucleares en Agricultura de la Comisión Chilena de Energía Nuclear, por la realización de la analítica isotópica.

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