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Agricultura Técnica, Vol. 63, No. 2, April-June, 2003, pp. 202-206 DISEMINACIÓN NATURAL DEL VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE SHARKA (Plum pox virus, PPV) EN TRES TEMPORADAS EN UN HUERTO DE DAMASCO.1 Natural spread of the virus causing Sharka disease (Plum pox virus, PPV) during three seasons in an apricot orchard. 1 Guido Herrera M.2* y Mónica Madariaga V. 2 1 Recepción originales: 22 de enero de 2002. Code Number: at03021 ABSTRACT The spread of Plum pox virus (PPV) was studied in an apricot (Prunus armeniaca L.) orchard established with healthy material in 1995 in the Metropolitan Region of Chile. The orchard was established in an area with high inoculum pressure with three cultivars: Dina, Castelbrite and Katy. The assessment of the trees was made every year by observation of symptoms and using policlonal antibodies for PPV. The strain found in the orchard was PPV-D (Dideron). Differences in the rate of PPV spread were observed among the cultivars. The spread of PPV in 1999, 2000 and 2001 was 6.6, 14.1 and 26.7%; 0, 0.6 and 3.3%; y 0, 0.5, and 2.1% for cvs. Dina, Castelbrite and Katy, respectively. Key words: epidemiology, Prunus armeniaca L., Sharka disease. RESUMEN La diseminación de Plum pox virus (PPV) fue estudiada en un huerto de damascos (Prunus armeniaca L.) establecido en 1995 con material sano en la Región Metropolitana de Chile. El huerto fue establecido en un área con una alta presión de inóculo con tres cultivares: Dina, Castelbrite y Katy. La evaluación de los árboles se realizó cada año mediante la observación de síntomas y el uso de antisueros policlonales para PPV. La raza presente en el huerto fue del tipo D (Dideron). La diseminación de PPV en los años 1999, 2000 y 2001 fue 6,6; 14,1 y 26,7%; 0; 0,6 y 3,3%; 0; 0,5 y 2,1% para los cvs. Dina, Castelbrite y Katy, respectivamente. Palabras claves: epidemiología, Prunus armeniaca L., enfermedad de Sharka INTRODUCCIÓN Los síntomas del Plum pox virus (PPV) fueron observados por primera vez en huertos de ciruelos (Prunus domestica L.) en Bulgaria, entre los años 1915 y 1918. Sin embargo, la naturaleza viral del problema se definió en 1932 por Atanosoff (1932), quién la denominó "enfermedad de Sharka". Entre los años 1932 y 1960, el agente viroso se desplazó infectando huertos de ciruelos y damascos (Prunus armeniaca L.) en Yugoslavia, Hungría, Rumania, Albania, Checoslovaquia, Alemania y Rusia. Posteriormente, en la década de 1970, se diseminó a Holanda, Francia e Italia, no sólo en ciruelos y damascos, sino también se le observó en durazneros (Prunus persica L.). España y Portugal fueron infectados en la década de 1980 (Llacer y Cambra, 1998). Posteriormente se detectó en Chile en 1992 (Herrera, 1994), India en 1994 (Bhardwaj et al., 1995), en EE.UU. en 1999 (Milius, 1999) y en Canadá en 2000 (CFI, 2000). En Chile se le identificó en 1992 en una vieja colección de frutales de carozo en la zona central del país (Herrera, 1994). Posteriormente, en la temporadas 1995, 1996 y 1997, prospecciones serológicas del virus realizadas en las regiones IV, V, VI y Región Metropolitana, donde se cultivan los carozos, determinaron una incidencia a nivel nacional de 15%, en un total de más de 10.000 plantas analizadas en tres temporadas de cultivo (Herrera et al., 1998). Bajo las condiciones chilenas el virus se encontró infectando damascos, durazneros (Prunus persica L.), nectarines (Prunus persica var. nectarina L.), ciruelos y almendros (Prunus dulcis L.). Estudios más detallados del virus demostraron la presencia de la raza "D" (Dideron) (Rosales et al., 1998). Aún cuando la distribución del virus en Chile incluye desde la IV a la VI regiones, la manifestación de los síntomas en las plantas frutales ha sido diferente a lo ocurrido en Europa. Síntomas evidentes en los frutos se han detectado sólo alrededor de la Región Metropolitana. En el resto del país, aunque se encuentran plantas serológicamente positivas, ellas no han mostrado síntomas en las últimas temporadas (Herrera y Madariaga, 2002). Estos aislamientos fueron estudiados molecularmente por Reyes et al. (2001), encontrando ciertas diferencias de estos aislamientos respecto del aislamiento tipo D. Desde la identificación de la enfermedad en Chile (Herrera, 1994), se ha estudiado la distribución de PPV en huertos de carozo (Herrera et al., 1998), y en viveros comerciales (Herrera y Madariaga, 2002) las razas del virus (Rosales et al., 1998) y características moleculares (Reyes et al., 2001). Sin embargo, no existen datos respecto de los grados de diseminación del virus dentro de los huertos infectados. El objetivo de esta investigación fue determinar el aumento en el número de plantas con síntomas de PPV en un huerto de damasco a partir de la temporada 1998. MATERIALES Y MÉTODOS El huerto de damasco en estudio estaba ubicado en la comuna de Nos, Región Metropolitana . El huerto plantado en 1995 incluía tres cultivares: Dina (1218 plantas), Castelbrite (957 plantas) y Katy (870 plantas). A partir de 1999, plantas de la variedad Dina mostraron los típicos síntomas de PPV consistentes en argollas cloróticas en la superficie de los frutos. Las pruebas inmunológicas con suero monoclonal denominado 5B por Asensio (1996) y moleculares con iniciadores específicos para las diferentes razas del virus indicaron la presencia de la raza D (Dideron) (resultados no mostrados) en las plantas infectadas. Se utilizaron dos técnicas para evaluar la diseminación anual de PPV en los huertos: ELISA y sintomatología. La identificación de plantas con síntomas se realizó una semana antes de la cosecha mediante la observación individual de los frutos de cada planta. Se estableció como planta enferma aquellas que mostraban a lo menos un fruto con argollas cloróticas en la superficie de los frutos. La identificación de plantas contaminadas con PPV mediante ELISA se realizó colectando 4 submuestras por planta (brotes y hojas nuevas), cada una obtenida de acuerdo a la orientación de los cardinales. Las muestras colectadas se mantuvieron en un contenedor con temperatura regulada a 15- 20°C hasta su procesamiento. Para la ejecución de la prueba ELISA se siguió la metodología descrita por Herrera (1994) y Herrera y Madariaga (2002). Para ello, con un rodillo manual se trituró aproximadamente 1 g de hojas y brotes nuevos, se diluyó (1/10 p/v) en tampón de extracción (Na2CO3 1,5 mM, NaHCO3 3,5 mM, pH 9,6). Luego, las muestras se centrifugaron a 2,875 g durante 5 min. En placas de poliestireno se adicionaron 100 µL del sobrenadante por muestra (antígeno) a cada celda, incluyendo siempre una repetición (dos celdas), la placa se incubó bajo condiciones de refrigeración (4°C) por una noche. Luego, las placas se lavaron con solución de lavado PBST (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM, NaHPO412H20 8,09 mM, KCl 2,68 mM y 0,05% Tween-20) cinco veces, cada vez durante 5 min. Luego, se adicionaron 100 µL de solución de bloqueo albúmina de huevo al 3% en PBS 1X (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO412H2O 8,09 mM, y KCl 2,68 mM) incubándose durante 2 h a 37ºC. Después de un lavado similar a los anteriores, se agregaron 100 µL de las inmunoglobulinas policlonales (SANOFI, Francia) diluidas en tampón de molienda (Albúmina de bovino 0,2% y PVP-40 2% en PBS 1X), incubándose durante 3 h a 37ºC. Posteriormente, se incorporó el segundo anticuerpo producido en cabra (Sigma 104, St. Louis, Missouri, USA) y conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, incubándose las placas toda la noche a 4°C. Finalmente, después de lavar, la reacción se reveló adicionando 1 mg mL-1 de p-nitrofenilfosfato en tampón de dietanolamina. Las reacciones inmunológicas se evaluaron en un lector ELISA (Bio Kinetic EL-312e, EE.UU.), considerando como muestras positivas, todas aquellas superiores al doble del valor de absorbancia de los controles sanos. RESULTADOS Número de plantas con síntomas por temporada. En el Cuadro 1 se muestran los resultados del número de plantas con síntomas en los frutos para cada variedad y año. Debido a que el predio está ubicado en una zona donde se detectó la enfermedad por primera vez en 1992, a partir de 1998 se observaron anualmente los frutos de las plantas en forma meticulosa. Ninguna de las variedades presentó plantas con síntomas durante la temporada 1998. La primera variedad en presentar plantas con los síntomas típicos de PPV fue Dina en la temporada 1999, en 6,6% de las plantas. En la temporada siguiente, la sintomatología se observó en Castelbrite (0,6%) y Katy (0,5%). Mientras que en Dina nuevas plantas aparecieron con síntomas, es así como, se observaron otras 7,4% de plantas con síntomas en los frutos, que sumados a las plantas afectadas en la temporada anterior, totalizó un porcentaje de 14,1%. En la temporada 2001, los porcentajes de plantas con síntomas aumentaron en todas las variedades. En Dina se presentaron otras 154 plantas contaminadas (12,6%) alcanzando en las tres temporadas a 26,7%. De igual forma, aumentaron los porcentajes de plantas afectadas en Castelbrite y Katy. Número de plantas ELISA positivo. En el Cuadro 1 se muestra el número y porcentajes de plantas ELISA positivo en las temporadas 2000 y 2001. En todas las variedades los porcentajes de plantas serológicamente positivas aumentaron desde la temporada 2000 a la 2001. Mientras Dina aumentó de 4,4 a 24,2%, Castelbrite lo hizo de 1,5 a 25,0% y Katy de 4,7 a 21,9%. Aumento anual de plantas mostrando síntomas en los frutos. En el Cuadro 1 se muestra el aumento anual de plantas con síntomas en los frutos en cada una de las variedades en las tres temporadas de estudio. En la variedad Dina el porcentaje de plantas con síntomas progresó más rápido que en las variedades Castelbrite y Katy. Así, en esta variedad PPV progresó desde 0% en 1998 a 6,6% en 1999, 14,1% en 2000 y 26,7% en 2001. Castelbrite y Katy llegaron a valores máximos de plantas con síntomas de 3,3 y 2,1%, respectivamente, en la última temporada estudiada. DISCUSIÓN En el presente estudio se estableció que en el cultivar Dina el número de plantas con síntomas aumentó en un lapso de cuatro años en un 26,7%. Estos resultados indican un grado de diseminación de PPV más lento que lo descrito por Llacer et al. (1992) para España, donde se requieren de 2 a 5 años para lograr un 100% de diseminación. Por otro lado, estudios realizados en Francia por Adamolle et al. (1994) indicaron períodos de 8-9 años para llegar a infecciones del 100% de las plantas. Desde el punto de vista epidemiológico, varios son los factores que determinan la velocidad de diseminación de los patógenos. Al respecto, trabajos realizados en Grecia indican que la velocidad de diseminación de PPV depende fundamentalmente de la cantidad de áfidos virulíferos y de la cercanía de las fuentes de inóculo (Varveri et al., 2001). No obstante lo anterior, Gottwald et al., (1995) cuestionaron los estudios epidemiológicos basados en expresión de síntomas más que en detecciones serológicas, puesto que no consideran los períodos de latencia de la enfermedad. En la presente investigación, el cultivar Dina presentó un total de 26,7% de plantas con síntomas al cabo de cuatro años, pero en la última temporada se detectó otro 24,2%, que aún cuando contenía el PPV, todavía no expresaba los síntomas. En tal caso, el total de infección de la enfermedad considerando plantas con síntomas y aquellas en período de latencia alcanzó a 50,9%. Cabe hacer notar también que los cultivares Castelbrite y Katy presentaron en la temporada 2001 un porcentaje total de plantas con síntomas más bajo que Dina. Sin embargo, los porcentajes de plantas serológicamente positivas no difirieron de aquellos encontrados en el cv. Dina. Esto sugiere que tanto en los cvs. Castelbrite como Katy gran parte de las plantas infectadas estaban en su período de latencia, y debería esperarse un aumento en el número de plantas mostrando los síntomas en los años sucesivos. En la presente investigación se observaron diferencias en la diseminación anual de PPV en tres cultivares de damascos. Mientras en el cultivar Dina el PPV se diseminó rápidamente alcanzando 26,7% de plantas con síntomas al cuarto año de observación, en Castelbrite y Katy la diseminación tuvo un grado inferior, llegando a 3,3 y 2,1%, respectivamente, al cuarto año. Esta diferencia podría ser explicada por un mayor grado de resistencia y/o tolerancia a la enfermedad de estas variedades, o bien, por razones de la propia epidemiología de la enfermedad. Al respecto, otros estudios de los autores (no publicados) encontraron que huertos del cv. Katy de 3 años de edad presentaban niveles de plantas con síntomas de 14%, sugiriendo, por la rapidez de aparición de síntomas, una falta de resistencia y/o tolerancia del cultivar a la infección de PPV. Por otro lado, los primeros síntomas de PPV se observaron en el cultivar Dina en la temporada 1999 (6,6%), posteriormente, en 2001 aparecieron en Castelbrite (0,6%) y Katy (0,5%). Por lo tanto, hace suponer que el PPV llegó desde otros lugares al cultivar Dina, y desde él el virus comenzó a diseminarse localmente a otros cultivares debido a la ubicación de éstos a favor del viento. Los resultados de la presente investigación son una primera aproximación respecto de la epidemiología de PPV bajo nuestras condiciones. El virus fue identificado por primera vez en Chile en 1992 (Herrera, 1994), desde esta fecha hasta finales de la década de los 90, aún cuando se detectó serológicamente PPV a nivel nacional, la enfermedad no se expresó en todo su potencial (Herrera et al., 1998). La información entregada en el presente trabajo sugiere que a lo menos en el huerto estudiado, están dados complejo de factores que contribuyen a la expresión máxima de PPV. Los resultados enfatizan la necesidad de estudiar otros aspectos epidemiológicos de la enfermedad en Chile, tales como especies de áfidos que diseminan PPV, su dinámica poblacional y su eficiencia de transmisión del virus. CONCLUSIONES El número de plantas de damascos con síntomas de la enfermedad de Sharka (Plum pox virus) en los frutos aumentó en cuatro temporadas en 26,7% en el cultivar Dina, 3,3% en Castelbrite y 2,1% en Katy. LITERATURA CITADA
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