Agricultura Técnica Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA ISSN: 0365-2807 EISSN: 0717-6333 Vol. 63, Num. 3, 2003, pp. 323-328

Agricultura Técnica, Vol. 63, No. 3, July-Sept, 2003, pp. 323-328

Nota científica

PLANTAS DOBLE HAPLOIDES GENERADAS POR CRUZA INTERGENÉRICA DE TRIGO x MAÍZ¹

Double haploid plants generated by wheat x maize intergeneric crosses¹

Claudio Jobet ^{2 *}, Javier Zúñiga²  y Hugo Campos de Quiroz³

¹Recepción de originales: 12 de noviembre de 2001.
La investigación reportada fue financiada por el Proyecto FONDEF D98I1074.
²Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro de Investigaciones Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile. E-mail: cjobet@carillanca.inia.cl *: Autor para correspondencia.
³ Semillas Pioneer, Chile. E-mail: camposh@phibred.com

Code Number: at03036

ABSTRACT

The use of double haploid techniques in plant breeding has the potential of shortening genetic improvement cycles in comparison to conventional methods, by means of the fast production (one cycle) of homozygous lines derived from segregant populations, which facilitates rapid homogenization and genetic stabilization.   The parental material used (F₃) was previously selected under field conditions. A high level of efficiency was reached in obtaining embryos (31.1%), which were rescued and germinated in vitro cultivationto later, by means of duplication via colchicine, to obtain more than 1000 double haploid wheat plants.  

Key words: Triticum aestivum L.,  Zea mays L., double haploids, breeding, selection.

RESUMEN

El uso de la técnica de dobles haploides en mejoramiento de plantas tiene el potencial de acortar los ciclos de mejoramiento genético en comparación a los métodos convencionales, mediante la producción rápida (un ciclo) de líneas homocigóticas provenientes de poblaciones segregantes, lo que conlleva a la rápida homogeneización y estabilización genética.  El material utilizado (F₃) en este trabajo fue previamente seleccionado bajo condiciones de campo. Se alcanzó una alta eficiencia en la obtención de embriones (31%) los cuales fueron rescatados y germinados in vitro para posteriormente, por medio de duplicación vía colchicina, obtener mas de 1.000 plantas de trigo doble haploides.

Palabras claves: Triticum aestivum L.,   Zea mays L., dobleshaploides, mejoramiento, selección.

INTRODUCCIÓN

La producción de dobles haploides (DH) en trigo (Triticum aestivum L.), a través de la cruza intergenérica entre trigo y maíz  (Zea mays L.), fue reportada por primera vez por Laurie y Bennett  en 1988. Desde entonces, de acuerdo con Suenaga et al. (1991), Suenaga et al.  (1997)  y Ma et al.  (1999), plantas DH en trigo  han sido exitosamente producidas por medio de la cruza de estas dos especies , demostrando tener una menor dependencia genotípica y una mayor eficiencia en alcanzar la haploidía cuando es comparado con otros sistemas, como son la cruza entre trigo hexaploide y cebada silvestre perenne (Hordeum bulbosum L.) (Snape et al., 1979),  y el cultivo de anteras (Kisana et al. 1993).

La metodología utilizada en general  para la obtención de DH ofrece múltiples ventajas para el mejoramiento genético de plantas. La más importante radica en la posibilidad de alcanzar rápidamente una completa homocigosis pudiendo de esta  manera reducir el tiempo y el costo en desarrollar nuevos potenciales cultivares (Khush y Virmani, 1996; Howes et al. 1998,  Liu et al., 2002). Este procedimiento, de acuerdo con  Goldringer et al. (1997),  permite evaluar poblaciones para caracteres cuantitativos y cualitativos, y desarrollar un  efectivo análisis genético de las relaciones epistásicas y varianzas genéticas existentes en trigo.  Otros beneficios asociados al uso de DH, de acuerdo con  Snape (1988; 1989) e  Inagaki y Mujeeb-Kazi (1998), están en la posibilidad de detectar ligamientos genéticos y determinar valores de recombinación génica, así como también  evaluar   posibles interacciones genéticas y eliminar el componente dominante de la varianza, lo cual permite la expresión diferencial de caracteres de naturaleza recesiva. Se estima, según Snape (1989), que sobre 95% de los caracteres requeridos en un genotipo elite de trigo son regulados por genes recesivos, por lo tanto todo mecanismo que permita la expresión diferencial de genes de condición recesiva necesariamente permitirá desarrollar mejoramiento genético de un modo eficaz y focalizado.  Del mismo modo, el uso de DH facilita el retorno más acelerado de la inversión en investigación, ya que incrementa sustancialmente la velocidad de respuesta del mejoramiento genético a los requerimientos del mercado  (Hu, 1997).

El principal problema asociado al  proceso de  haploidía es que la planta se somete a un solo ciclo de recombinación meiótica, considerado insuficiente debido a que normalmente existen efectos de ligamiento genético (Ma et al. 1999). De esta manera, el potencial de variación genética que se obtiene como resultado de la recombinación del material genético aportado por los progenitores,  pudiese no estar disponible y, por  lo tanto, utilizable en próximas generaciones (Hu, 1986). Para evitar esta situación, diferentes estrategias en mejoramiento de plantas han sido propuestas, siendo una de ellas el realizar la haploidización en generaciones más avanzadas como F₂  o F₃, con el fin de favorecer  la recombinación génica, y/o realizar una selección de aquellos caracteres de interés antes de la producción de haploides (Hu, 1997, Ma et al. 1999).

El objetivo de la presente investigación fue establecer la metodología para la obtención de plantas doble haploides a nivel de Población F₃ (PF₃)  con el fin de incorporarla como herramienta complementaria a los programas de mejoramiento genético de plantas.  

MATERIALES Y MÉTODOS

El material parental (Cuadro 1) fue seleccionado sobre la base de parámetros de adaptabilidad (resistencia a enfermedades fungosas prevalentes en la zona sur del país, precocidad, hábito de desarrollo y crecimiento), agronómicas (vigor de macolla, altura de planta, resistencia a tendedura, tipo de espiga y color), de productividad (número y tamaño de espigas, peso de grano) y de calidad molinera y panadera (volumen de sedimentación, contenido de proteínas en el grano, calidad de gluten, proteínas de alto peso molecular, entre otras). Las cruzas se realizaron en el Centro Regional de Investigación, INIA-Carillanca (38º 41` lat. Sur y 72º 25` long. O.)  en 1997, sembrándose la  PF₁  en 1998, la PF₂  en 1999 y la PF₃  en el 2000. Para evitar la desventaja descrita por Hu (1986), en el sentido que poblaciones F₁  no alcanzan a tener suficiente recombinación meiótica, las poblaciones utilizadas para la cruza intergenérica correspondieron a material segregante F₃, las cuales habían sido derivadas de una población F₂ sometidas previamente a un proceso de selección en campo, específicamente para los caracteres antes descritos.

Siembra de poblaciones segregantes de trigo
La progenie F₂  de cada una de las ocho cruzas utilizadas, previamente vernalizada, fue sembrada bajo condiciones de invernadero en surcos de 2 m  con una separación  0,20 m entre cada uno. Al suelo, previamente esterilizado, se le aplicó una fertilización equivalente, de acuerdo a análisis de suelo, de 260 kg ha^-1  de N (salitre sódico y  urea), a la siembra y a la macolla (estados  0 y 26, respectivamente, escala de Zadoks et al., 1974. Un total de 72,9 kg ha^-1  de P (superfosfato triple)  y 65 kg ha^-1  de K (sulfato de potasio) fueron aplicados a la siembra. Un grano de cada F₂  fue sembrado a 10 cm sobre la hilera en un total de 20 hileras, repitiéndose este proceso cada 20 días, con el fin de mantener las plantas de trigo PF₃  receptivas para ser polinizadas por  el maíz .

Siembra genotipos de maíz
Para efectos del presente trabajo se utilizaron como polinizantes maíces regionales llamados Rodeo y Codopille, por sus características de mayor precocidad y menor tamaño de planta, lo que facilitó su manejo en el invernadero. Cada grano fue pregerminado con el fin de acelerar la germinación, y posteriormente sembrado en  invernadero bajo condiciones de alta luminosidad (60.000 a 80.000 lux) y temperatura (38ºC), de acuerdo a lo descrito por Mendoza, (1998).

Metodología
El procedimiento se basó en los protocolos desarrollados por Suenaga y Nakajima (1989) y Laurie et al. (1990), con algunas modificaciones establecidas por Mujeeb-Kazi (2000). En general la metodología consistió en lo siguiente: las flores de cada espiga principal de cada planta de trigo F₃  seleccionada fueron emasculadas manualmente 3-4 días antes de la antesis (estado 57, escala de Zadoks), cortándose cada una en la base del tallo y manteniéndolas en una cámara de crecimiento a 22°C y fotoperíodo de 16: 8 (luz y oscuridad), cubiertas con bolsas de polietileno, con el propósito de evitar la deshidratación, para finalmente proceder a polinizar cada flor con polen fresco de maíz. Las espigas polinizadas se mantuvieron  en  cámara de crecimiento, con las condiciones descritas anteriormente, en solución acuosa que contenía 100 mg L^-1  de 2,4-D, 40 g L^-1  de sacarosa y 8 ml L^-1  de ácido sulfuroso (24%).  Aproximadamente catorce días después, se procedió al rescate de los embriones, desinfectando las semillas con una solución de NaHCl al 20% y 1% de Tween 20, durante 15 min, depositando los embriones en tubos con medio basal de acuerdo a lo descrito por  Suenaga y Nakajima (1989), esto es medio basal Murashige & Skoog 0,5X más 20 g L^-1  de sacarosa y 6% de agarosa.  

Cuando las plántulas alcanzaron alrededor de 1-2 cm, se trasladaron a la cámara de crecimiento hasta un desarrollo de dos a tres hojas ( estado 12 a 13, escala de Zadoks). En este estadío fueron trasplantadas a macetas individuales (suelo y vermiculita), y mantenidas en salas con temperaturas de 22 ºC  y fotoperíodo de 16 : 8 (luz y oscuridad) hasta alcanzar las cuatro  a seis hojas verdaderas (estado  14 a 16, escala Zadoks).  En esta etapa, las raíces de cada planta  fueron introducidas en una solución de colchicina de 500 mg L^-1 en 2% dimetil sulfoxido (DMSO) y mantenidas por 6 h a una temperatura de 22 ºC, con aireación permanente y protegidas de la luz directa. Luego, las plantas fueron transferidas a macetas individuales, las que contenían suelo esterilizado y con una mezcla equivalente a 245 kg ha^-1 de N (Supernitro), 72,9 kg ha^-1 de P (Superfosfato triple) y 66,4 kg ha^-1 de K (Sulfato de potasio), las cuales finalmente fueron establecidas en invernadero hasta su posterior  cosecha.

Se confirmó el estado haploide y el éxito en la duplicación por medio del recuento de cromosomas mediante observación microscópica en extensiones teñidas de meristema radicular (Mujeeb-Kazi y Miranda, 1985), el cual se realizó antes y después de la duplicación de cada planta. Finalmente, cada planta DH fue cosechada en forma individual y la semilla fue sembrada en el 2001 en invernadero y en el campo del Centro Regional de Investigación Carillanca, del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA).  

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se destaca la fuerte variación fenotípica  que  se observó en la población DH, entre y dentro de las cruzas, donde fue posible observar plantas de diferente altura, precocidad, vigor a la macolla y en general tipo agronómico diversos y diferentes con respecto a sus progenitores. Esta situación confirma lo expresado por Hu (1986), en el sentido de incrementar la posibilidad de mayor recombinación génica postergando la selección del material  madre hasta etapas posteriores de segregación, F₂   y  F₃.  Se utilizaron  dos genotipo de maíz, Rodeo y  Codopille, ya que la utilización de determinados genotipos de maíz, según Suenaga y Nakajima (1989), puede tener una influencia significativa sobre el desarrollo de embriones y planta haploide. Por otro lado, Inagaki y Tahir (1990), encontraron que las diferencias significativas para la obtención de embriones entre cruzas intergenéricas, dependían de los efectos aportados por  el  genotipo del trigo. En este contexto, y considerando esta premisa se trabajaron con progenies derivadas de nueve genotipos de trigo de diverso origen.

Sobre la base de los resultados obtenidos en la presente investigación, se alcanzó un alto nivel de eficiencia, el cual como promedio superó 21% de embriones obtenidos a partir de semillas producidas en todos y cada uno de los cruzamientos (Cuadro 2). Es importante considerar el alto porcentaje de éxito logrado en la generación de plantas DH a partir de embriones haploides (31,1%), cifras ya reportadas en los trabajos publicados por Suenaga (1994),  Suenaga et al. (1997), Mendoza (1998), y Mujeeb-Kazi et al. (2001), destacándose la cruza Baroudeur x Dalcahue-INIA (39,3%) y Baroudeur x Renaico-INIA (39,1%). El hecho que se repita uno de los progenitores sugiere la existencia de un efecto genotípico por parte de la madre, tal como lo establecieron Inagaki y Tahir (1990).

Al respecto, varios autores destacan la existencia de efectos asociados a los genotipos, los cuales han mostrado variaciones en la eficiencia entre un 0,9 y 35%  para la obtención de embriones  productos de cruzas trigo x maíz (Suenaga y Nakajima, 1989; Suenaga et al. 1991; Mendoza, 1998). Por su parte, Laurie y Reymondie (1991) encontraron que las diferencias observadas estaban  con relación al hábito de desarrollo de los trigos (invierno y/o primavera) y que dentro de estos grupos no existen diferencias en la producción de haploides. Esta situación no fue del todo clara entre los cruzamientos utilizados en la presente investigación, los cuales incluyeron genotipos de un mismo o de distinto hábito de crecimiento, siendo la eficiencia de semilla a embriones y embriones a DH similar y sin un patrón definido entre genotipos (Cuadro 2).

Sin embargo, asumiendo la existencia de estas variaciones genotípicas, hoy día la gran mayoría de los cultivares utilizados en estos estudios han demostrado la capacidad de producir plantas haploides y subsecuentemente plantas DH. Si consideramos las ventajas que tienen los DH enunciadas anteriormente, permitirá que programas de mejoramiento de trigo puedan utilizar una herramienta complementaria a los esquemas convencionales utilizados al día de hoy.

CONCLUSIONES

La metodología presentada para obtener plantas dobles haploides (DH) en trigo a través de la cruza intergenérica trigo x maíz puede ser considerada como una importante herramienta de ser utilizada por programas de mejoramiento de trigos, con el fin de traspasar  y fijar rápidamente nuevos atributos como ser: tipo agronómico, resistencia a enfermedades, genes de tolerancia a stress, genes de calidad industrial,  al germoplasma adaptado de una región en particular.

AGRADECIMIENTOS

A la Srta. Paola Rathgeb, Ing. Ejec. Agrícola y al Señor Gonzalo Marín, Técnico Agrícola, por su destacada participación y colaboración en el desarrollo de este trabajo.

LITERATURA CITADA

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