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Agricultura Técnica, Vol. 63, No. 4, Oct-Dec, 2003, pp. 387-393 Investigación USO DE LA ESPECTROSCOPÍA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO PARA EL ANÁLISIS DE CALIDAD DE ENSILAJE DE MAÍZ1 Use of near infrared reflectance spectroscopy to analyze corn silage quality 1 Daniel Cozzolino , , Alberto Fassio 3 , Enrique Fernández 3 The Australian Wine Research Institute
(AWRI), Waite Road, PO Box 197, Urrbrae, South Australia 5064. E-mail: Daniel.Cozzolino@awri.com.au *:
Autor para correspondencia. Recepción de originales: 24 de septiembre de 2002 Code Number: at03044 ABSTRACTNear infrared reflectance spectroscopy (NIRS) was used to predict the chemical composition of corn silage samples ( Zea mays L.). Two hundred samples of a wide range of both chemical characteristics and origins were scanned in a monocromator instrument (NIRS 6500, NIRSystems, Silver Spring , Maryland , USA ) over the wavelength range between 400 to 2500 nm, in reflectance mode. Calibration coefficients of determination (R2cal ) and standard error in cross validation (SECV) were 0.94 (SECV: 0.74%), 0.94 (SECV: 0.54%), 0.91 (SECV: 1.8%), and 0.90 (SECV: 3.8%) for DM, crude protein (CP), acid detergent fiber (ADF) and neutral detergent fiber (NDF) respectively, dry weight basis. The results demonstrate the potential of NIRS for the routine analysis of corn silage to determine DM, CP and ADF. Keywords: Near infrared reflectance spectroscopy, NIRS, quality, corn silage, Zea mays L. RESUMEN La espectroscop í a de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) fue utilizada para predecir la composici ó n química del ensilaje de ma í z ( Zea mays L). Doscientas muestras de un amplio rango de características físico químicas y origen, fueron leídas en un equipo monocromador (NIRS 6500, NIRSystems, Silver Spring, Maryland¸ USA) en el rango de longitudes de onda de 400 a 2500 nm, en reflectancia. Los coeficientes de determinación en calibración (R 2cal ) y el error estándar de la validación cruzada (SECV) fueron 0,94 (SECV: 0,74%), 0,94 (SECV: 0,54%), 0,91 (SECV: 1,8%), y 0,90 (SECV: 3,8%) para MS, proteína cruda (PC), fibra detergente ácida ( FD A) y fibra detergente neutra ( FD N) en base materia seca. Los resultados demuestran el potencial del NIRS para el análisis de rutina del ensilaje de ma í z para MS, PC, y FD A. Palabras clave : Espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano, NIRS, calidad, ensilaje de maíz, Zea mays L. INTRODUCCIÓNEl ensilaje de planta entera de maíz ( Zea mays L.) es la base de la suplementación invernal y estival, en los sistemas de producción animal intensiva en Uruguay. Los cambios bacteriológicos y químicos durante el proceso del ensilaje pueden afectar el rendimiento en nutrientes y la calidad final del ensilaje como alimento para los animales. Por esta razón es necesario conocer la calidad y valor nutritivo de los alimentos para uso animal, para el mercadeo de productos agrícolas a nivel predial y comercial. Los métodos cuantitativos y cualitativos tradicionales de análisis de alimentos son dificultosos, demandan tiempo, mano de obra y son de un elevado costo (Murray, 1986; Osborne et al. , 1993; Cozzolino, 1998; Cozzolino et al ., 2000). Las propiedades ópticas de los alimentos, y en particular la aplicación de la espectroscop í a de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), se emplea desde la década del 70 en la industria alimenticia, farmacéutica, y petroquímica, como alternativa a los métodos químicos y químicobiológicos tradicionales (Norris et al. , 1976; Murray, 1986; Cozzolino et al ., 2000). El NIRS es una técnica rápida, no destructiva ni contaminante, y de gran exactitud siempre que se sigan los procedimientos adecuados para crear las ecuaciones de calibración (Alomar y Fuchslocher, 1998; Givens y Deaville, 1999). El método utiliza la región de longitudes de onda entre los 700 y 2500 nanómetros (nm) del espectro electromagnético (Alomar y Fuchslocher, 1998; Murray, 1996; Deaville y Flinn, 2000). Este método se basa en que cuando la luz incide sobre una muestra, una parte de los fotones es transmitida a través de la misma, siendo el resto absorbido. La absorción de energía por la muestra produce que los enlaces entre C-H, O-H y N-H, componentes principales de la estructura básica de las sustancias orgánicas, vibren en distintas formas (Givens y Deaville, 1999). La interacción de la energía con la materia obedece a la ley de Lambert-Beer, que establece que la absorbancia a cualquier longitud de onda es proporcional al número o concentración de las moléculas absorbentes presentes en el camino recorrido por la radiación (Alomar y Fuchslocher, 1998; Cozzolino, 1998). Esto determina que para un material de naturaleza química heterogénea, el espectro obtenido en la región del infrarrojo cercano es la combinación de bandas de absorciones parciales sobrepuestas o muy cercanas, que suelen confundirse en una línea suavizada, en que se encuentran picos, valles y curvaturas en forma de hombro (Alomar y Fuchslocher, 1998; Deaville y Flinn, 2000). Al desarrollar una calibración NIRS, la información espectral (óptica) se relaciona mediante un algoritmo con la información de la composición físico-química (método de referencia) a través de la aplicación de modelos estadísticos como son la regresión múltiple, los componentes principales y los cuadrados mínimos parciales. El objetivo principal de este trabajo fue explorar el uso de la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) en el análisis cuantitativo de PC, MS, y fibras detergente ácido y neutro del ensilaje de maíz. MATERIALES Y METODOSSe utilizaron doscientas muestras de ensilaje de maíz ( Zea mays L.)
(n = 200) provenientes de distintas regiones de Uruguay. Las muestras frescas
fueron secadas a 60 ° C en estufa de aire forzado por 48 h previo análisis
químico y NIRS. Las muestras fueron posteriormente molidas en un molino
tipo Wiley con mallas de 4 y 1 mm (Arthur H. Thomas, USA) y analizadas químicamente
en el laboratorio de Nutrición Animal del Instituto Nacional de Investigación
Agropecuaria (INIA), Estacion Experimental La Estanzuela, Colonia, Uruguay.
Materia seca (estufa a 103 ° C), cenizas (incineración de las muestras
a Las muestras de ensilaje de maíz (secas y molidas) fueron analizadas en el rango de longitud de onda de 400 - 2500 nm en un instrumento monocromador (NIRS 6500, NIRSystems, Silver Spring, Maryland, USA) en una cuveta circular de 50 mm de diámetro y 2 mm de espesor (número de parte NIRS IH-0325). Los datos de reflectancia se guardaron como el logaritmo (1/R) (donde R = reflectancia) a 2 nm de intervalo (1050 datos por muestra). La luz difusa reflejada (R) por la muestra fue registrada en detectores de sulfuro de plomo, amplificada, digitalizada, transformada en log 1/R y enviada a una computadora para su almacenamiento y procesamiento (Alomar y Fuchslocher, 1998). En forma paralela a la señal digital de luz reflejada, la computadora recibió una señal que representa la longitud de onda utilizada, de modo que a cada valor de reflectancia almacenada, le corresponde una longitud de onda. El conjunto de valores de diferentes longitudes de onda para una muestra constituye su espectro que representa la huella dactilar o espectro típico o representativo de la muestra. Se desarrollaron las ecuaciones de calibración y predicción usando el método estadístico de los cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) (Shenk y Westerhaus, 1993). Las ecuaciones de regresión se detallan a continuación: Y = b 0 + b1 x 1 + ..b n x n donde Y representa el parámetro químico o característica (PC, FD A, etc.); b 0 es el intercepto, b 1 a b n los coeficientes de la regresión, x 1 a x n absorbancias a diferentes longitudes de onda. Se empleó la validación cruzada para evitar el sobre ajuste de los modelos (NIRS 2, 1995) y se aplicó corrección de los espectros mediante el procedimiento de SNV (varianza normal estándar) (Barnes et al. , 1989). El tratamiento matemático aplicado a los espectros fue (1,5,5); donde el primer número indica el orden de la derivación o substracción (uno es la primera derivada del logaritmo 1/R), el segundo número es la amplitud o distancia entre los segmentos a sustraer, y el tercer número es la longitud del segmento a ser suavizado. Se exploraron otros tratamientos matemáticos (1,4,4), (2,5,5) y (2,10,10), los cuales no determinaron una mejora en las calibraciones. Las estadísticas de la calibración calculadas incluyen el error estándar de la calibración (SEC), el coeficiente de determinación en la calibración (R 2cal ), el error estándar de la validación cruzada (SECV) y el coeficiente de determinación en la validación cruzada (R 2val ) (Shenk y Westerhaus, 1993). Las ecuaciones de calibración fueron seleccionadas sobre la base de minimizar el error estándar de la validación cruzada (SECV) y/o el error estándar de la calibración (SEC). El programa utilizado fue NIRS 3.01 de ISI (Infrasoft International, Maryland, USA) (Shenk y Westerhaus, 1993). El error estándar de la calibración y el de la validación cruzada fueron calculados por el programa mediante la formula: SEC/V : [(Quim NIRS) 2/ (n t 1)] ½ Donde Quim es el valor del método de referencia; NIRS: valor de predicción NIRS; n: número de muestras en la calibración, t: número de términos del modelo de calibración (Shenk y Westerhaus, 1993). Se utilizó la eliminación de outliers que incorpora el programa NIRS 3.01. Muestras con un t > 2,5 y un H (H: distancia de Mahalanobis) > 3 fueron consideradas outliers. RESULTADOS Y DISCUSIÓNEn el Cuadro 1 se presenta las composición química, media, rango
y la desviación estándar de las muestras de ensilaje de maíz
utilizadas para construir las calibraciones NIRS. En el Cuadro 2 se presentan
los resultados obtenidos para las calibraciones NIRS de los distintos parámetros
químicos analizados. De mayor a menor los coeficientes de determinación
en calibración Cuadro 1. Composición química (%) de muestras de ensilaje de maíz utilizadas para la construcción de calibraciones NIRS (base materia seca, %). Table 1. Chemical composition (%) of corn silage samples used to perform the NIRS calibrations (dry matter basis, %).
MS: materia seca; PC: proteína cruda; C: cenizas; FD A: fibra detergente ácido; FD N; fibra detergente neutro, NIRS: espectroscopía de reflectancia en el infrarojo cercano. Cuadro 2. Calibración y validación cruzada NIRS para distintos parámetros de calidad en ensilaje de maíz (base materia seca, %). Table 2. NIRS calibration and cross validation for distinct quality parameters of corn silage (% dry matter basis).
MS: materia seca; PC: proteína cruda; C: cenizas; FD A: fibra detergente ácido;
FD N; fibra detergente neutro; SEC: error estándar de calibración;
R 2cal : coeficiente de determinación en calibración; SECV:
error stándar de la validación cruzada. El contenido de humedad residual de la muestra vari ó considerablemente con el tiempo de conservación en el laboratorio, y con el tiempo transcurrido entre el análisis y la lectura NIRS, lo que puede explicar los bajos R 2 en calibración y altos SECV para las predicciones de fibra. Del mismo modo, el método de análisis utilizado (estufa 105 ° C) no es el más recomendado para la determinación de humedad de la muestra cuando se utiliza como método de referencia para la construcción de ecuaciones de calibración NIRS, particularmente con ensilajes. El efecto del secado sobre la composición de las distintas fracciones y c ó mo afectan a las predicciones NIRS ha sido tratado por varios autores (Alomar et al ., 1999). Distintos autores comprobaron que la liofilización o titulación (método Karl Fischer) son mejores como métodos de referencia en la determinación de humedad con la técnica NIRS (Shenk y Westerhaus, 1993; Murray, 1993). El poder de predicción de NIRS decrece con el aumento de la complejidad del parámetro analizado, como es el caso de la FD N y cenizas. En la región del infrarrojo es difícil determinar entidades complejas como la FD N, ya que los datos espectrales obtenidos por el NIRS representan con mayor exactitud a la estructura química real de la muestra que a estructuras o elementos determinados por la química húmeda, como son las fracciones fibra ácida o neutra o sus constituyentes que componen la pared celular de los vegetales (Abrams et al ., 1987). Estas últimas no corresponden a entidades moleculares definidas, sino a determinaciones empíricas que, por tanto, no permiten definir los grupos químicos reales involucrados (Alomar y Fuchslocher, 1998). Para el caso de las cenizas, se debe destacar que las sustancias inorgánicas y los minerales no poseen absorción en la región del infrarrojo. Sin embargo, los minerales y otros elementos inorgánicos se pueden asociar a la estructura orgánica bajo la forma de óxidos, quelatos u otros complejos, e indirectamente ser estimados por el NIRS. Para pH, las calibraciones obtenidas son moderadas. La determinación de pH por NIRS está asociada a la correlación con grupos OH de la muestra, principalmente en correspondencia con el contenido de humedad. Para cenizas y pH las calibraciones obtenidas son consideradas con un valor de predicción medio. La relación entre la predicción NIRS y los datos reales para MS y PC se presentan en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Una forma de evaluar las ecuaciones NIRS con relación a su precisión y exactitud es a través de la relación entre la desviación estándar del análisis químico y el error estándar de la validación cruzada (SD/SECV). Si esta relación es menor a 3 las ecuaciones resultan en un bajo poder de predicción (Murray, 1993). La relación para los parámetros en este trabajo fue 3.8 para MS; 3 para PC; 1.96 para C; 2.33 para FD A y 2.31 para FD N, respectivamente. La Figura 3 presenta el espectro típico del ensilaje de maíz en la región del visible y del infrarrojo cercano. Se observan absorbancias en la región del espectro visible a 420 y 660 nm, que corresponden con la absorción de la banda Soret y con la clorofila. En la región del infrarrojo se observan absorciones a 1200, 1450 y 1930 nm que corresponden a la absorción de los grupos OH, asociados con el contenido de agua de la muestra. En la zona de los 1730 a 1750 nm corresponde con la absorción de los enlaces CH, asociados a lípidos y ácidos grasos (Murray, 1986; Cozzolino, 1998; Cozzolino et al ., 2000). Absorciones entre 2100 y 2400 nm corresponden a la absorción de los enlaces CH y combinaciones (Murray, 1986). CONCLUSIONESSe obtuvieron buenas calibraciones para MS y PC, y regulares para las fracciones de fibra ( FD A y FD N) e inferiores para C y pH. Este trabajo demuestra que la fácil colección de espectros a través del NIRS permite una r á pida determinación de la calidad del ensilaje de ma í z y un aumento de la velocidad en la realización de los an á lisis de rutina en los laboratorios de nutrición animal. AGRADECIMIENTOSLos autores agradecen la colaboración de los técnicos del laboratorio de Forrajes y Concentrados de INIA La Estanzuela. El trabajo fue financiado por INIA Uruguay. LITERATURA CITADA
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