Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 17, Num. 1, 2000, pp. 48

O Cruz,1 Y Cruz,1 Y Espino,1 G Furrazola,1 M Navarro,1 M Gil,1 R Bouyón,1 A Domínguez,1 J Forreira,1 L Rodés,2 R Páez,3 JC Sánchez,4 F López,1 R Sosa,4 A Franco,4 M Quintana,4 L Herrera1

1División de Inteferones. 2División Química-Física. 3División Desarrollo Biofarmaceútico. 4Aseguramiento de la Calidad. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Apartado Postal 6162, CP 10600, Ciudad Habana, Cuba. E mail: ifn@cigb.edu.cu Fax (53-7)21 8070.

Introducción

El IFN alfa 2b humano recombinante se considera actualmente como un producto de gran demanda en el mercado biotecnológico debido al amplio espectro de aplicaciones en el tratamiento de diversas enfermedades humanas como agente antiviral y antiprotiferativo. Durante casi 20 años se han venido desarrollando diversas tecnologías para la obtención de un producto con una calidad óptima, y se han aplicado diferentes métodos de purificación en los cuales se incluyen específicamente la cromatografía de afinidad por anticuerpos monoclonales [1].

Actualmente, debido a los altos costos productivos que generan la producción de IFN Alfa 2b recombinante mediante la tecnología de purificación con anticuerpos monoclonales, se necesitan otras alternativas que posibiliten la obtención de un producto con niveles de pureza similares o superiores a la cromatografía de inmunoafinidad [2] y con niveles de recuperación elevados. El método de purificación por cromatigrafía de afindad por iones metalicos IMAC ha sido seleccionado como una de las alternativas para esta sustitución.

En este trabajo se reflejan los distintos resultados obtenidos a escala semipreparativa en el incremento del nivel de pureza del debris celular que posteriormente se solubiliza y se incorpora a las etapas de purificación, y los diferentes resultados que se obtuvieron en la IMAC que se establece en sustitución de la cromatografía de afinidad por anticuerpos monoclonales.

Materiales y Métodos

Equipamiento. Homogeneizador de Alta Presión APV Gaulin, Centrifuga Beckman J21, Homogeneizador T50, Detector UV, 280 nm (Pharmacia LKB), Sistema HPLC (Pharmacia LKB), Columna cromatográfica XK 16120 (Pharmacia), Los reactivos empleados fueron de calidad purísima, gel de quelato IDA-Sepharose CL-6B, gel Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia), gel de intercambio catiónico Fractogel EMD COO- 650 (Merck, Alemania), columna analítica C8, semipreparativa C4 y preparativa C4 de fase inversa (rp) VYDAC (USA).

Ruptura y lavado celular. La biomasa obtenida en el proceso de fermentación (conteniendo 10% de IFN respecto al total de proteínas), fue sometida a un proceso de ruptura celular y lavado, de acuerdo con las condiciones establecidas previamente [3].

Desnaturalización y renaturalización. El material lavado que contenía el IFN en forma insoluble fue solubilizado en una solución de GuHCI 6 M, Tris 50 mM, NACI 50 mM en condiciones reductoras (DTT 2 mM) a una concentración de proteínas de 3 mg/mL. La renaturalización del IFN se realizó por dilución lenta, usando una solución RE (Tris 50 mM, NACI 50 mM pH 7,2). Se utilizó como agente oxidante CuSO4 80 mM.

Purificación. A partir de resultados previos en cuanto a las condiciones de trabajo a escala analítica para la purificación de IFN alfa 2b humana recombinante por IMAC [4], se realizaron estudios a escala preparativa en cuanto a capacidad, velocidad lineal y presencia de impurezas. Con las mejores condiciones se realizaron tres lotes consecutivos a escala productiva, con lo que se demostró la eficacia de la nueva tecnología que se propone a usar en cuanto a calidad del producto final y disminución de costos.

Técnicas analíticas. La concentración de IFN fue determinada por ELISA, las proteínas totales por Lowry, la pureza por electroforesis y por RP-HPLC analítico, así como las técnicas específicas para la liberación de un lote de materia prima activa [5].

Resultados y Discusión

La combinación del lavado inicial con detergentes y a continuación con urea, ofreció resultados de interés en este trabajo por obtenerse el IFN con valores de pureza superiores a 50%, manteniendo un recobrado del IFN mayor de 70%. Esto permitió purificar este material por IMAC y se logró el producto con una pureza superior a 80%, y luego por RP-HPLC para obtener un producto de alta calidad (99% de pureza).

En los estudios realizados en cuanto a capacidad de IFN alfa 2b en la matriz de IMAC, se obtuvieron niveles de hasta 4 mg de IFN/mL de gel, valor considerado 8 veces superior al obtenido mediante cromatografía de inmunoafinidad. De las distintas velocidades lineales utilizadas, se seleccionó como la mejor variante la de 40 cm/h, obteniéndose una recuperación y pureza del material eluído (RP-HPLC) de 85% y 80%, respectivamente.

A partir de los resultados anteriores se diseñaron las nuevas etapas de lavado del debris celular y de IMAC, y se llevó a cabo la producción de un lote de materia prima activa a escala preparativa. El producto final obtenido se sometió a todos los análisis para la determinación de la identidad de la molécula. Finalmente, se procedió a elaborar tres lotes a escala productiva con el objetivo de obtener la aprobación por la entidad de control de medicamentos en el uso de esta nueva tecnología en la producción de IFN alfa 2b recombinante. Todos los lotes fueron liberados de manera satisfactoria, y la tecnología fue aprobada por la autoridad nacional regulatoria (CECMED).

References

1. Stachelin T, Hobbs DS, Kung HF, Lai CY, Pestka S. Purification and characteñzation of recombinant leukocyte interferon (IFLrA) with monoclonal antibodies. J Biol Chem 1981;256:9750–4.

2. International Patent Classification. Number WO 89/03225. Purification of monomeric interferon.

3. Cruz Y y colaboradores. Mejoramiento del proceso de semipurificación del interferón alfa 2b humano recombinante utilizando lavados celulares. Avances en Biotecnología Moderna. Volumen 4. 1997.

4. Cruz O y colaboradores. Sustitución del paso de cromatografía de inmunoa-finidad por la cromatografía de afinidad por iones metálicos en la purificación de interferón alfa 2b humano recombinante. Avances en Biotecnología Moderna. Volumen 4. 1997.

5. Registro Sanitario lnterferón alfa 2b Humano Recombinante. Parte ll: Documentación Química-Farmaceútica-Biológica. 1997. Habana. Cuba.

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