Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 17, Num. 2, 2000, pp. 127

Biotecnología Aplicada 2000;17:127

Inmunización de ADN en ratones con variante truncada
de la gB del virus herpes simple 2

Ana B Pérez,¹ Juan Fló,¹ Mauro Saturnega,² Francisco Baralle²

¹Instituto "Pedro Kourí" Autopista Novia del Mediodía, km 6½, La Lisa, Marianao 13,
Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: anab@ipk.sld.cu
²International Center of Genetic Engineering and Biotechnology
Padriciano 99, Trieste 34 1 00, Italia.

Code Number: ba00040

Introducción

La infección por virus herpes simple (VHS) humano constituye un problema de morbilidad en humanos a nivel mundial. Numerosos estudios han demostrado el papel de la inmunidad mediada por células (IMC) en el control de esta infección [1, 2]. La recurrencia de la infección latente ha sido relacionada a una disminución de la IMC antiviral [3]. La inmunización en
modelos animales de algunas glicoproteínas o construcciones de ADN que expresan los componentes virales, proveen protección parcial o total contra el reto viral [4, 5]. La glicoproteína (gp) B forma parte de la envoltura viral y contribuye a la penetración del VHS a la célula hospedera. En nuestro estudio, usamos un modelo de vacuna de ADN para investigar la capacidad de desencadenar una respuesta inmune en animales inmunizados e inducir protección frente al reto viral de una forma truncada de la gB del VHS2.

Materiales y Métodos

El gen codificante de la gB truncado en su extremo 5' (sin 400 pb) fue amplificado por PCR a partir del genoma viral obtenido de células Vero infectadas. Dicha secuencia fue clonada en un vector pcDNA3 digerido por BamHI, para ser expresado bajo el control del promotor de CMV humano. La construcción fue chequeada por digestión con enzimas de restricción y secuenciación, y se verificó su expresión usando el sistema de transcripción/traducción TNT en lisado de reticulocitos de conejo (Promega). Tras la purificación del ADN con kits de mega prep Qiagen, 100 mg del plásmido recombinante fueron inyectados en ratones C57BI por vía intramuscular en un esquema de tres dosis con intervalos semanales. Se usó como control un grupo de animales inmunizados con el plásmido y como control positivo, animales inmunizados con 106 PFU del virus también por vía intramuscular.

Una parte de los animales fueron retados intravaginalmente con el virus. En el resto de los animales se evaluó la reacción de hipersensibilidad retardada (DTH) por inoculación del virus o control celular en la oreja de aquellos y medición del grosor del pabellón auricular a las 24 h.

Se colectaron sueros de los animales para medir la respuesta de anticuerpos mediante un ELISA indirecto, y se evaluó la respuesta de células T in vitro frente al virus, mediante el análisis por citometría de flujo de la expresión de CD25 en células CD4+ incubadas en presencia de antígenos virales.

Resultados y Discusión

Los animales inmunizados con el plásmido recombinante, al ser retados con el virus, llegaron a 50% de supervivencia (dato preliminar), mostrando un ligero nivel de protección, al ser comparados con aquellos que recibieron el plásmido solo, los cuales murieron en su totalidad. Por su parte, los animales inmunizados con el virus se protegieron, no presentando signos de infección genital, ni se recuperó virus en los lavados vaginales después de la inoculación viral. Se comprobó una respuesta de células T in vivo frente al virus a través de la medición de la DTH, la cual fue significativa al compararse con el control celular (p < 0,05). No se detectaron títulos de anticuerpos en los animales inmunizados con ADN, en cambio sí altos títulos en aquellos inoculados con el virus. Al ser enfrentados los esplenocitos de animales inmunizados con el plásmido recombinante a antígenos virales, y analizados por citometría de flujo, obtuvimos un incremento evidente en la expresión de CD25 en células T CD4+ que corrobora el reconocimiento y activación de éstas por estos antígenos.

La ausencia de anticuerpos detectables se explica por la localización intracelular de la proteína expresada, un hecho que limita la accesibilidad del antígeno para el reconocimiento y estimulación de las células B [6]. Por otra parte, la ubicación en el citoplasma de la proteína traducida debe garantizar su accesibilidad al complejo LMP y, por tanto, la presentación eficiente a las células T citotóxicas, la cual es fundamental en la respuesta antiviral. Aunque estudios recientes demuestran que células musculares transfectadas pueden inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos [7], parece ser importante la liberación del antígeno al espacio extracelular para ser endocitado por células presentadoras de antígenos inductoras de inmunidad. Existen evidencias de la dependencia de la presentación de antígenos asociados a MHC II para desencadenar respuestas CTL a vacunas de ADN [8]. El bajo nivel de protección en los animales retados pudiera estar relacionado con esto.

References

1. Nash AA, et al. J Gen Virol 1980;48: 351–57.

2. Carr JA, et al. J Virol 1997;71:7799–803.

3. Iwasaka T, et al. Infect Immun 1983;42: 955–64.

4. Cehimi J, et al. Eur J Immunol 1993;23: 1826–30.

5. Bourne N, et al. J Infect Dis 1996;173: 800–7.

6. Roitt I. Immunology 1996;4–7.

7. Sigal L. J, et al. Nature 1999;398:77–80.

8. Whitton JL, et al. Vaccine 1999;17: 1612–9.

Papers from Biotecnología Habana`99 Congress.
November 28-December 3, 1999.