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Diseño y validación de una celda de difusión para estudios de liberación in vitro de biomoléculas

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. AP 6162, CP 10600, La Habana, Cuba. Fax: (53-7) 21 8070, 21 4764, 33 6008; E-mail: ehardy@cigb.edu.cu

En este trabajo se diseñó y construyó una nueva celda para la liberación in vitro de biomoléculas. La celda, cuyo diseño está basado en el modelo descrito por Keshary y Chien, posee dos compartimentos: un sitio donante, y otro receptor que cuenta con una capacidad de 12 mL, y un área superficial de 2,01 cm². Un pequeño magneto que rota a una velocidad constante, y una chaqueta externa a través de la cual circula agua termostatada, permiten mantener la homogeneidad y la temperatura del medio receptor. Las condiciones de funcionamiento del sistema (0,5 g de semisólido aplicado, 200 µL de muestra colectada periódicamente, 600 rpm de velocidad de agitación, 37 ºC en la cámara receptora y 24 h de incubación de la membrana en el medio receptor) se determinaron mediante el estudio sistemático de los parámetros de funcionamiento más importantes. Mediante el análisis de los coeficientes de variación y el análisis de varianzas, se demostró que el sistema es repetible, reproducible y robusto. Esta celda será de gran utilidad para el estudio de la liberación y penetrabilidad en la piel de proteínas dosificadas en forma semisólida.

Palabras claves: celda de difusión, factor de crecimiento epidérmico, FCE, liberación in vitro, validación

Design and validation of a diffusion cell for in vitro biomolecule release studies. In this work, a new cell for the in vitro release of biomolecules was designed and built. The cell, whose design is based on the model described by Keshary and Chien, is composed by two compartments: a donor site and a receptor site that has a total effective volume of 12 mL, and a surface area of 2.01 cm². A small magnet that rotates at a constant speed, and an external jacket through which thermostated water circulates, allowed us to keep the homogeneity and the temperature of the receptor medium. The functioning conditions of the system (0.5 g semisolid applied, periodically collected 200-µL samples, 600-rpm stirring rate, 37 ºC in the receptor chamber, and 24-h soaking of the receptor medium membrane) were determined by a systematic study of the most important functioning parameters. By means of the coefficient of variation (CV) analysis and the variance analysis, it was demonstrated that the system is repeatable, reproducible and robust. This cell will be of great utility for the study of the release profiles and the skin penetrability of semisolid dosified proteins.

Keywords: diffusion cell, EGF, epidermal growth factor, in vitro release, validation

Mediante el uso de las técnicas más modernas de ingeniería genética y biotecnología, ha sido posible la obtención, a escala industrial, de un conjunto de biomoléculas de interés farmacéutico. Un grupo importante de estas biomoléculas de origen recombinante (por ejemplo, interferones y factores de crecimiento), ya han evidenciado un amplio potencial en la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades. El factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (FCEhr) se ha utilizado para acelerar la reepitelización cutánea [1], y el interferón alfa (IFN-a), para el tratamiento de enfermedades de origen viral como las ocasionadas por el herpes simple y el papilomavirus humano [2]. Por lo general, estos tratamientos requieren la aplicación tópica del producto farmacéutico.

El desarrollo de formas farmacéuticas semisólidas que contengan biomoléculas recombinantes, se puede facilitar mediante la determinación de los perfiles de velocidad correspondientes a la liberación y penetrabilidad de la molécula en la piel. Los experimentos in vitro que se emplean para estudiar la cinética de liberación de moléculas a partir de semisólidos, se han conducido tradicionalmente mediante el empleo de las denominadas celdas de liberación [3-5]. La celda de difusión de Franz se ha usado con frecuencia en la determinación de la cinética de absorción percutánea de muchas drogas (por ejemplo, nitroglicerina). Esta celda se caracteriza por tener un volumen efectivo en el compartimento receptor, y un área superficial apropiada para la difusión de las drogas. Sin embargo, sus propiedades hidrodinámicas no son óptimas debido al mezclado ineficiente y a la imposibilidad de que la temperatura sea controlada estrictamente durante la experimentación. Estas limitaciones han sido eliminadas con la introducción del sistema de liberación de tipo vertical desarrollado por Keshary y Chein [6 y referencias internas].

Es notorio que no existen lineamientos generales en las farmacopeas (por ejemplo, en la Farmacopea de los Estados Unidos de América XXIII, la Farmacopea Británica 98) en relación con el desarrollo de celdas de liberación in vitro, razón por la cual muchos investigadores tienen la opción de desarrollar sus propios sistemas [7, 8]. En este trabajo se diseñó y construyó una celda de liberación propia que cuenta con un compartimento receptor similar al de la celda de Keshary y Chien [6 y referencias internas]. Las condiciones experimentales que garantizan el correcto funcionamiento de la celda fueron establecidas. Además, se evaluaron la reproducibilidad, la repetibilidad y la robustez del sistema de liberación sobre la base de la medición y el análisis estadístico de parámetros de funcionamiento muy importantes: velocidad de agitación en el medio receptor, cantidad de semisólido aplicado, tiempo de incubación de la membrana en el medio receptor, volumen de muestra colectada a partir del medio receptor y temperatura de la cámara receptora.

El FCEhr y los anticuerpos monoclonales CB-EGF1 y CB-EGF2, fueron suministrados por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba). El carbopol 940 y otros excipientes utilizados en la fabricación de la jalea fueron igualmente suministrados por el CIGB. Los reactivos empleados (albúmina de suero humano [ASH], leche deslipidizada y otras sales utilizadas durante la preparación de las soluciones tampones del ensayo inmunoenzimático [ELISA] tipo sandwich) fueron adquiridos de las firmas Sigma (St. Louis, Mo, EUA) y Merck (Darmstadt, Alemania).

La celda de liberación empleada (Figura 1) es una modificación de la utilizada por Keshary y Chien [6 y referencias internas], hecha de vidrio borosilicato 3.3 (DIN ISO 3585 Schot ROHrglas, Alemania). El compartimento receptor posee un volumen de aproximadamente 12 mL y un área superficial de 2,01 cm². Se introdujo un pequeño magneto y se puso a girar a una velocidad constante para homogeneizar la solución receptora. La celda se revistió con una chaqueta externa a través de la cual recircula el agua a 37 ºC para mantener constante la temperatura del medio. La membrana de acetato de celulosa (Sartorius, sm 11106, Alemania) con un diámetro de poro de 0,45 µm, se incubó en el medio receptor durante 24 h antes de ser colocada en la parte superior del compartimento. Se tomaron precauciones para evitar la formación de burbujas de aire entre la membrana y el medio.

Figura 1. Representación esquemática de la celda de difusión. 1) cámara de la muestra, 2) cámara de muestreo, 3) membrana, 4) entrada de agua atemperada, 5) salida de agua atemperada, 6) magneto. Las unidades están expresadas en milímetros, escala 1:2.

Se aplicaron 150 ng de FCEhr en solución en la cámara receptora descrita anteriormente, con la excepción de que no se colocó la membrana sintética. Esta cámara contenía tampón fosfato salino (NaCl 0,136 M; KCl 0,00268 M; Na₂H·PO₄ 0,01 M; KH₂PO₄ 0,00176 M; pH 7,4) con o sin ASH 0,15%. Se colectó un volumen de 150 µL de muestra al cabo de 0,5; 1; 2; 4; 6; 8 y 24 h. El volumen eliminado se remplazó con igual volumen de medio fresco. Las muestras colectadas fueron conservadas a -20 ºC para su posterior cuantificación.

En paralelo con este experimento, se incubó una solución control de FCEhr en un tubo de ensayo a igual concentración y temperatura. El objetivo fue determinar si había afectación térmica de la molécula durante el transcurso del experimento.

Se condujo un experimento similar al descrito anteriormente, excepto que se incorporaron 150 ng de FCEhr en el medio receptor que contenía ASH 0,15% en contacto directo con la membrana de acetato de celulosa de 0,45 µm. En paralelo, se condujo un experimento control en el que no se incluyó la membrana sintética.

El estudio de validación incluyó la determinación de los parámetros repetibilidad, reproducibilidad y robustez (Categoría III, Farmacopea de los Estados Unidos, 1995).

La repetibilidad y reproducibilidad de este sistema se determinaron mediante el uso de tres celdas de difusión con características idénticas: velocidad de agitación 600 rpm y temperatura 37 ºC. El ensayo se llevó a cabo mediante la colocación de 0,5 g de jalea formulada con FCEhr a 10 µg/g de base semisólida en el sitio donante. El grado de repetibilidad se estableció mediante el análisis de los coeficientes de variación (CV) de la cantidad de FCEhr liberado en el tiempo, para cada una de las tres celdas de difusión durante 6 días consecutivos (n = 6). La reproducibilidad también se determinó por comparación de los CV del FCEhr liberado entre las tres celdas empleadas en un mismo día, en condiciones idénticas.

Para determinar la robustez del sistema, se introdujeron pequeñas variaciones en los parámetros de funcionamiento más importantes: cantidad de jalea aplicada (0,5-0,65 g), volumen de las muestras colectadas a partir del medio receptor (150-200 µL), tiempo de incubación de la membrana en el medio (20-24 h), velocidad de agitación del medio receptor (400, 600, 800 rpm), y temperatura del medio receptor (35, 37, 39 ºC). Se incluyó un total de tres réplicas por cada ensayo de manera aleatoria, y con los valores medios se determinó la velocidad de liberación del FCEhr para cada una de las variaciones introducidas en los diferentes parámetros seleccionados.

La concentración de FCEhr se calculó mediante un ELISA de tipo sandwich [9, 10] cuyo procedimiento se describe a continuación.

Se aplicaron 100 µL/pocillo del anticuerpo CB-EGF1 (10 mg/mL) disuelto en Na₂CO₃ 0,1 M/NaHCO₃ 0,1 M (pH 9,6-10,5). Transcurrido el tiempo de incubación (3 h, 37 ºC), la placa fue lavada con Tween 20 al 0,05%. Las muestras problemas y la curva patrón de FCEhr preparada a las concentraciones de 10, 5, 2, 1 y 0,5 ng/mL, fueron diluidas en tampón PBS 1X (NaCl 0,136 M; KCl 0,00268 M; NaHPO₄ 0,01 M; KH₂PO₄ 0,00176 M; pH 7,4) que contenía leche deslipidizada 0,5%. Se aplicaron 100 µL/pocillo y la placa se incubó a 37 ºC durante 1 h, seguido del lavado de la placa. Se aplicaron 80 mL/pocillo del anticuerpo CB-EGF2 conjugado con peroxidasa y la placa se lavó después de ser incubada 1 h a 37 ºC. Se adicionaron 100 mL/pocillo de la solución sustrato (5,5 mg de o-fenilendiamina, 5,5 mL de H₂O₂ 30%, disueltos en 11 mL de tampón sustrato [ácido cítrico 0,1 M/Na₂HPO₄ 0,2 M; pH 5,0]). Transcurridos 10-20 min, se adicionaron 50 mL/pocillo de ácido sulfúrico 3 M. Los valores de absorbancia se leyeron a 492 nm en un espectrofotómetro Multiscan (Sensident Scan, Merck, Darmstadt, Alemania).

El análisis estadístico se realizó mediante el programa Microsoft Excel 97 (Microsoft Corporation, USA). La prueba t de Student se utilizó para comparar los valores de recobrado del FCEhr durante la selección del medio receptor y la evaluación de la adsorción de la biomolécula a la membrana sintética. Las diferencias significativas se definieron para p < 0,05.

Mediante un análisis de varianza, se compararon los valores de velocidad de liberación obtenidos para cada uno de los parámetros ensayados en la evaluación de la robustez del sistema.

Selección del medio receptor. El porciento de recobrado de FCEhr en diferentes medios receptores, se investigó con la finalidad de seleccionar las mejores condiciones que eviten una posible adsorción de la molécula a las superficies del vidrio de la cámara receptora de la celda. El FCEhr (150 µg) diluido en las diferentes soluciones receptoras (tampón salino con y sin ASH), se colectó en el compartimento receptor en ausencia de la membrana sintética. El experimento se realizó en condiciones controladas de temperatura (37 ºC ± 0,2) y se realizaron muestreos periódicos para cuantificar el contenido de FCEhr por ELISA.

La Tabla 1 (columna 4) muestra estos resultados y su análisis estadístico. El porciento de recobrado de FCEhr fue mucho mayor cuando se incorporó la ASH (0,15%) en la solución tampón. Con respecto al medio libre de ASH, se observaron diferencias significativas en el recobrado de FCEhr a partir de las 4 h de estudio (p > 0,05). Dado que la concentración inicial de las muestras de FCEhr no varió durante el período de estudio (datos no mostrados), es posible que las pérdidas observadas en el medio sin ASH se deban a la adsorción de la biomolécula a las paredes de la cámara receptora. En otros trabajos similares, se ha referido el empleo de la albúmina de suero bovino como componente de la solución receptora [11].

Tabla 1. Influencia del medio receptor y la membrana sobre los por cientos de recobrado del FCEhr.

Tiempo (h)	Recobrado (%)			Recobrado (%)
Tiempo (h)	ASH (-)^a	ASH (+)^b	p	Memb. (+)^c	Memb. (-)^d	p
0,5	94,13	96,57	0,77	97,47	96,57	0,91
1	94,47	101,90	0,34	107,78	101,90	0,40
2	91,80	101,52	0,24	100,45	101,52	0,89
4	80,22	100,56	0,01*	103,36	100,56	0,64
6	80,35	102,02	0,00**	103,73	102,02	0,77
8	82,26	102,91	0,03*	101,54	102,91	0,16
24	72,13	101,81	0,01*	98,88	101,81	0,71

Media (n = 6) expresada como porciento de la concentración inicial del FCEhr aplicado. Nivel de significación: *p < 0,05, **p < 0,01. ^aSolución fosfato como medio receptor. ^bASH y tampón fosfato como medio receptor. ^cFCE en la solución receptora (ASH + tampón fosfato) sin membrana. ^dFCE en la solución receptora (ASH + tampón fosfato) en contacto directo con la membrana.

A partir del análisis de estos resultados, se utilizó ASH en el medio receptor en el resto de los experimentos.

Determinación de la adsorción de FCEhr a la membrana sintética. Toda membrana empleada en un estudio in vitro debe conservar su integridad durante el período de estudio y adsorber muy poco la proteína de interés. Un segundo experimento permitió verificar que la membrana de acetato de celulosa de 0,45 µm prácticamente no adsorbió FCEhr (Tabla 1, columna 7).

No hubo diferencias significativas en los recobrados de FCEhr en el medio receptor cuando se utilizó o no la membrana sintética. Estos resultados se pueden explicar sobre la base de la capacidad preferencial de unión y bloqueo de la albúmina en los sitios de adsorción de la membrana [12], lo que evitó la pérdida de FCEhr.

Perfiles de liberación. En la Figura 2, se muestran los perfiles de liberación típicos obtenidos para las variantes de FCEhr en jalea y en solución (control) mediante el empleo de este sistema. La difusión rápida del FCEhr y los altos por cientos de recobrado (> 90%) obtenidos para la preparación control, evidenciaron la capacidad de la membrana de no limitar el libre paso de la molécula hacia el medio receptor. Para la jalea, se observó un perfil de liberación característico de este tipo de base hidrosoluble. El principio activo se liberó fundamentalmente por un mecanismo de simple disolución.

Figura 2.. Perfiles de liberación típicos para el FCEhr en jalea y en solución.

Repetibilidad. El grado de repetibilidad se estimó mediante el análisis de los CV de la cantidad de molécula liberada para cada tiempo analizado (Figura 3). Los CV fueron superiores para los tiempos iniciales, período en el cual el sistema aún no había alcanzado un estado estacionario. Este período se estableció a partir de los 30 min.

Figura 3. Repetibilidad (n = 6) expresada como coeficiente de variación (CV) del FCEhr liberado a partir de la jalea (10 µg/g) en función del tiempo para tres celdas de difusión. Resultados obtenidos en 6 días diferentes.

Teniendo en cuenta los CV obtenidos, comprendidos entre 12% y 27%, y que el aporte en la variabilidad del ELISA utilizado para cuantificar el FCEhr es superior a 5%, se puede considerar que el sistema es repetible. Una fuente importante de variabilidad de este sistema debió ser aportada por la propia metodología, fundamentalmente en los pasos de extracción y remplazamiento de la solución receptora. Sin embargo, los valores de variación están comprendidos dentro del rango aceptable de trabajo para productos biológicos [13].

Reproducibilidad. Para el análisis de este parámetro, se procedió de forma similar a la metodología seguida para la determinación de la repetibilidad, con la única diferencia de que los CV fueron establecidos a partir de los resultados obtenidos para cada una de las celdas. La Figura 4 demuestra que el funcionamiento de la celda es repetible, debido a que los CV obtenidos estaban entre 7% y 20%, cuya variabilidad es esencialmente aportada por el propio sistema analítico. Estos valores fueron más homogéneos para los tiempos mayores que 0,5 h, momento a partir del cual el sistema alcanzó el estado estacionario.

Figura 4. Reproducibilidad expresada como coeficiente de variación (CV) del FCEhr (10 µg/g) en función del tiempo entre cada celda de difusión (n = 3) en condiciones similares.

Robustez. Para analizar la robustez del sistema, se determinaron los valores de las constantes de liberación (µg/cm²/h) para cada uno de los parámetros de funcionamiento evaluados. Los resultados estadísticos de este análisis se presentan en la Tabla 2. Para cada factor se muestran los valores de F experimental y F crítica. En todos los casos, el valor de F experimental fue inferior al valor de F crítica, lo que permitió inferir que el sistema es robusto para todas las variables experimentales ensayadas.

Parámetros	F experimental	F crítica
Velocidad de agitación (rpm)	2,17	4,26
Tiempo de incubación de la membrana (h)	0,02	5,99
Cantidad de muestra aplicada (g)	1,40	5,99
Cantidad de muestra extraída (µL)	0,06	5,99
Temperatura del medio receptor (ºC)	0,09	4,26

Estos resultados están en concordancia con los obtenidos en otros trabajos previos relacionados con el empleo de celdas de difusión [14-16]. Por lo general, aunque se ha observado que pequeñas variaciones en la temperatura no han afectado significativamente la cantidad de fármaco liberado, se recomienda que este parámetro sea controlado estrictamente.

Se diseñó, construyó y validó una celda de liberación que permite medir los perfiles de liberación de biomoléculas a partir de preparaciones semisólidas. Además, se seleccionó el medio receptor adecuado y los mejores resultados se obtuvieron con la incorporación de ASH 0,15% en el tampón salino y con la membrana sintética de acetato de celulosa 0,45 µm, por conservar su integridad, por su capacidad mínima de adsorción y por no limitar la libre movilidad de la molécula desde el sitio donante hasta la solución receptora.

En relación con la validación del funcionamiento de la celda, se demostró que el sistema es repetible, reproducible y robusto para las condiciones experimentales evaluadas. A partir de este estudio, se concluye que el sistema de liberación diseñado y la metodología empleada son aceptables para continuar los estudios de liberación de fármacos a partir de preparaciones semisólidas. Esto proporcionará una información útil que puede guiar el desarrollo de formulaciones semisólidas con biomoléculas.

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