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Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 1, March 2001, pp. 17-19
Osmani Rodríguez Cardoso*
Gerardo García-Illera Recibido en septiembre del 2000. Aprobado en octubre del 2000 Code Number: BA01003 RESUMEN El objetivo de este estudio fue comprobar si la isoterma de Langmuir es válida en el equilibrio para el sistema antígeno de superficie recombinante del virus de la hepatitis B-anticuerpo monoclonal CB.Hep-1, inmovilizado en una matriz de Sepharose CL-4B, y, en tal caso, determinar sus parámetros característicos. El adsorbato se diluyó en tampón Tris 20 mM, EDTA 3 mM, NaCl 1 M, pH 7,2. Los experimentos se realizaron a 25 ºC. Se empleó el método batch para generar los datos de concentración de antígeno en la fase líquida en el equilibrio, y el balance de masa para calcular las concentraciones en la fase sólida en el equilibrio. Los ploteos de Scatchard, doble recíproco y semirecíproco reflejaron una dependencia lineal, lo que indica un comportamiento según el modelo de Langmuir. En cada caso se obtuvo la recta de mejor ajuste por el método de los mínimos cuadrados. Los valores de la capacidad máxima del adsorbente y la constante de disociación, se obtuvieron de la ecuación de la recta ajustada mediante el ploteo semirecíproco, que fue el de mejores resultados. Con estos parámetros se representó la ecuación de Langmuir gráficamente. Este resultado permite afirmar que la isoterma de Langmuir gobierna la interacción antígeno-ligando en el rango de concentración examinado. Palabras claves: adsorción bioespecífica, CB.Hep-1, cromatografía de afinidad, HBsAg, isoterma de Langmuir, purificación de proteínas ABSTRACT Determination of the Adsorption Isotherm Parameters for the System Hepatitis B Surface Antigen–Monoclonal Antibody CB.Hep-1 on an Immunoaffinity Adsorbent. A study was performed in order to verify the possibility of using the Langmuir isotherm to describe the equilibrium behavior in the system recombinant Hepatitis B surface antigen–monoclonal antibody CB.Hep-1, immovilized in a Sepharose CL-4B matrix. The adsorbate was diluted in 20 mM Tris buffer containing 3 mM EDTA and 1 M NaCl, pH 7.2. The experiments were carried out at 25 ºC. Data of antigen equilibrium concentrations in the liquid phase were generated by the batch method and the equilibrium concentrations in the solid phase were calculated by mass balance. The Scatchard, double-reciprocal and semireciprocal plots showed a linear dependency, which indicates a behavior according to the Langmuirean model. In each case the data were fitted by least squares regression. The characteristic parameters of maximun adsorbent capacity and dissociation constant were obtained from the fit in the semireciprocal plot, which was the best, and used to chart the Langmuir equation. This result shows that the Langmuir isotherm governs the interaction antigen-ligand in the concentration range examined. Keywords: affinity chromatography, biospecific adsorption, CB.Hep-1, HBsAg, Langmuir isotherm, protein purification Introducción El antígeno de superficie recombinante del virus de la hepatitis B (rHBsAg, por sus siglas en inglés) es el principio activo de la vacuna contra esta enfermedad. Es una proteína que se obtiene a partir de un cultivo de levaduras modificadas genéticamente como un agregado en forma de partículas intracelulares. La purificación cromatográfica se realiza mediante la inmunoafinidad, con el empleo de un gel de agarosa como matriz, al que se le ha acoplado un anticuerpo monoclonal (AcM) denominado CB.Hep-1 como ligando. Este tipo de cromatografía basado en la interacción bioespecífica antígeno-anticuerpo, es altamente selectiva por la sustancia de interés y, por lo tanto, es el paso clave de toda la etapa de purificación La relación entre la concentración de un adsorbato en la fase sólida (q*) y su concentración en la fase líquida (c*), en el equilibrio, se expresa a través de la llamada isoterma de adsorción. El objetivo de este trabajo fue verificar si la isoterma de Langmuir —la más usada comúnmente en los sistemas biológicos [1]— es adecuada para la interacción HBsAg-AcM CB.Hep-1 en un rango determinado de concentración de antígeno, y, de ser así, determinar sus parámetros característicos. Con ese fin fue necesario obtener valores experimentales de c* y q*. Se pueden emplear tres transformaciones lineales de la ecuación de Langmuir para determinar la capacidad máxima del adsorbente y la constante de disociación [1, 2]. La comprobación de que una isoterma determinada puede describir el equilibrio en un sistema dado, y el cálculo de sus parámetros, es un resultado que se puede utilizar en modelos matemáticos que permiten predecir el comportamiento de la adsorción en columnas cromatográficas, en determinadas condiciones de operación. Por lo tanto, estos modelos se pueden emplear en la optimización del proceso. Materiales y Métodos Materiales El inmunoadsorbente empleado se preparó en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba) a partir de un gel de Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia), y el AcM CB.Hep-1 [3] se produjo también en el CIGB. Se usó el HBsAg purificado; es decir, la materia prima activa (MPA) procedente del proceso de producción. Los reactivos químicos fueron de calidad analítica (Merck, Alemania). Se empleó agua de Milli Q para preparar todas las soluciones. Preparación del HBsAg Se le realizó un cambio de buffer a la MPA en una columna PD-10 de Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia). De esta forma, el antígeno quedó en una solución de Tris 20 mM, EDTA 3 mM, NaCl 1 M, pH 7,2, que es el tampón de equilibrio y de lavado en la cromatografía de inmunoafinidad. Por medio de espectrofotometría UV a 280 nm (espectrofotómetro Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech, Suecia), se determinó la concentración del antígeno para preparar ocho diluciones diferentes. Una vez preparadas las ocho soluciones, se determinaron nuevamente sus densidades ópticas a 280 nm para obtener las concentraciones reales de HBsAg. Datos de la adsorción en el equilibrio Los datos experimentales fueron generados mediante el método batch [1, 2, 4]. El procedimiento consistió en mezclar 1 mL del inmunoadsorbente equilibrado y 10 mL de una solución de antígeno de concentración conocida, a 25 ºC durante 3 h. En ensayos previos se observó que se lograba una aproximación razonable al equilibrio con este tiempo (Figura 1). Figura 1. Variación en el tiempo de la concentración de HBsAg en la fase líquida (c0 = 0,204 mg/mL). Se emplearon tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL para poner en contacto ambas fases. El mezclado se realizó con agitación suave en un balancín. Posteriormente, se centrifugó el contenido de los tubos y se separó el sobrenadante en alícuotas para determinar la concentración de antígeno no adsorbido mediante espectrofotometría UV a 280 nm. El experimento se realizó para ocho concentraciones iniciales de valores menores, similares o mayores que la concentración de antígeno de la muestra que se aplicó en la columna de inmunoafinidad, durante el proceso productivo (concentrado de Celite filtrado). Para cada concentración inicial se hicieron tres réplicas y se promedió el valor de c*. La concentración q* se calculó mediante balance de masa. Isoterma de Langmuir Esta isoterma se desarrolló asumiendo que [5]: • La adsorción es completamente reversible. • A cada sitio de adsorción se acopla una sola molécula. • La molécula de adsorbato no cambia su conformación durante la adsorción. • No hay interacción lateral entre moléculas vecinas adsorbidas. • Se puede formar una monocapa de moléculas adsorbidas a lo sumo. Según este modelo, la relación entre la concentración en la fase sólida en el equilibrio (q*) y la concentración en la fase líquida en el equilibrio (c*) se puede expresar como [1, 2]:
donde: Esta ecuación se puede expresar de las siguientes formas:
Las expresiones (2), (3) y (4) son transformaciones lineales de la ecuación (1), conocidas como representaciones gráficas de Scatchard, doble recíproca y semirecíproca, respectivamente [1, 2]. Si los datos experimentales muestran una dependencia lineal según estas transformaciones, entonces el sistema sigue un comportamiento de acuerdo con la isoterma de Langmuir. De esta forma, es posible determinar los parámetros qm y Kd por medio de la recta que mejor se ajuste a los datos. Los ploteos, el análisis de regresión y la representación gráfica de la ecuación (1) se realizaron mediante el programa Microsoft Excel (MicrosoftÒ Corporation, E.U.A). Resultados y Discusión En la Tabla se muestran las concentraciones iniciales (c0) de las soluciones de antígeno empleadas, los valores de c* para cada réplica, el valor de c* promedio, la desviación estándar y el valor de q* correspondiente calculado por el balance de masa del sistema. Tabla. Valores experimentales de c* obtenidos para cada una de las concentraciones iniciales de antígeno. Los valores de q* se calcularon mediante el balance de masa haciendo uso del valor promedio de c*
DE, desviación estándar. En el ploteo de Scatchard de los datos experimentales (q*/c* vs. q*), presentado en la Figura 2, se manifestó un carácter lineal que se hizo más evidente aún en los ploteos doble recíproco (1/q* vs. 1/c*) y semirecíproco (c*/q* vs. c*) que se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente. Esto se comprobó con la evaluación de la linealidad mediante un análisis de regresión por el método de los mínimos cuadrados. Las rectas ajustadas en cada caso, junto con sus ecuaciones y coeficientes de regresión lineal, se muestran también en las figuras. Figura 2. Representación de Scatchard de los datos experimentales. Recta ajustada por el método de los mínimos cuadrados. Figura 3. Representación doble recíproca de los datos experimentales. Recta ajustada por el método de los mínimos cuadrados. Figura 4. Representación semirecíproca de los datos experimentales. Recta ajustada por el método de los mínimos cuadrados. El mejor ajuste fue el de la representación semirecíproca, con un coeficiente de regresión de 0,992 para una distribución aleatoria de los residuos. Con el intercepto y la pendiente de esta recta se calcularon los parámetros qm y Kd, lo que dio como resultado una capacidad máxima del adsorbente de 1,105 mg/mL y una constante de disociación de 0,0159 mg/mL. Con el empleo de estos valores, se representó la ecuación (1) gráficamente y se ubicaron los puntos experimentales. Se pudo apreciar una aproximación aceptable a la teoría, como se muestra en la Figura 5. Figura 5. Puntos experimentales y representación gráfica de la ecuación de Langmuir (1) con el empleo de los parámetros obtenidos de la recta ajustada en el representación semirecíproca. Si bien Liapis [5] señaló que se puede describir el comportamiento experimental a través de este modelo, aun en sistemas en los que no se cumplen las premisas de la isoterma de Langmuir estrictamente, el alto grado de correlación obtenido con el ajuste de los datos sugiere que las desviaciones con respecto a estas premisas deben ser pequeñas, en caso de que el sistema estudiado no las satisfaga todas. En conclusión, el resultado permite afirmar que el equilibrio en el sistema HBsAg-AcM CB.Hep-1 se puede describir mediante la isoterma de Langmuir en el rango de concentración analizado. Referencias
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