Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 18, Num. 1, 2001, pp. 24-27

Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 1, March 2001, pp. 24-27

Code Number BA01005

RESUMEN

En el presente trabajo se muestra una metodología que consiste en la extracción, identificación y cuantificación de diferentes subclases de lípidos, la cual posibilitó el estudio comparativo de la composición lipídica del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) obtenido por vía recombinante, que se llevó a cabo en dos plantas de producción con diferente personal. Se analizó cada una de las subclases presentes (fosfolípidos; mono, di y triglicéridos; ácidos grasos no esterificados y ésteres de colesterol) y se obtuvo que no existían diferencias significativas (p > 0,05) para cada una de ellas, al igual que para el contenido total de lípidos. Se llegó a la conclusión de que es posible emplear ambas instalaciones para desarrollar los procesos de producción del HBsAg, y que la nueva instalación no afecta el perfil característico del HBsAg recombinante.

Palabras claves: cromatografía en capa fina, extracción, subclases de lípidos

Abstract

Lipid Composition in Recombinant Hepatitis B Surface Antigen. The present article shows a methodology for the extraction, identification and quantification of different lipid subclasses, which allowed the comparative study of lipid composition for the recombinant Hepatitis B surface antigen (rHBsAg) produced at two different facilities. Each lipid subclass was analyzed (phospholipids; mono, di and triglycerides; non-esterified fatty acids and cholesterol esters) and no significant differences between processes were found (P > 0.05) for each subclass and for total lipid content. We concluded that both facilities may be used for the production of rHBsAg and that the new one does not alter rHBsAg lipid profile.

Keywords: extraction, lipid subclasses, thin layer chromatography

Introducción

Las autoridades regulatorias internacionales son cada vez más exigentes en relación con la caracterización de los diferentes componentes de una producción biotecnológica, debido al carácter específico de los productos obtenidos por vía recombinante. Las diferencias entre lotes de producto o entre diversas modificaciones de su proceso de obtención, pudieran estar asociadas a inestabilidades genéticas durante el cultivo o a contaminaciones microbianas en el proceso de fermentación, por lo que se requiere una rigurosa caracterización de las proteínas, los carbohidratos y los lípidos presentes en las vacunas producidas mediante esta tecnología [1].

Este tipo de producción presenta un conjunto de características que lo distinguen de los tradicionales. El aspecto principal es que se basa en el empleo de organismos vivos modificados genéticamente para la obtención de productos para uso humano, por lo que es una industria altamente regulada desde el punto de vista de su proceso productivo, sus registros de productos, y los métodos de ensayo que se deben aplicar para certificar su calidad y demostrar la consistencia del proceso productivo.

Diversos trabajos [2-4] relacionados con la expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg, del inglés Hepatitis B surface antigen) en levaduras, indican que las partículas producidas en este microorganismo presentan una estructura lipoproteica estabilizada por interacciones específicas de la superficie de la proteína y los fosfolípidos de membrana de las células de levadura. Los lípidos participan en el mantenimiento de la conformación nativa del HBsAg, por lo que la eliminación de parte de los componentes lipídicos produce cambios conformacionales que disminuyen el contenido de a-hélice en 50%. Por tal motivo, se considera que las interacciones lípido-proteína son responsables de la formación adecuada de la estructura helicoidal de la proteína que estabiliza la conformación de las regiones hidrofílicas expuestas que portan los sitios antigénicos.

La separación y aislamiento de las diferentes subclases de lípidos, previo a su caracterización, se ha utilizado ampliamente con el empleo de diversos métodos como la cromatografía en columna de gel de sílica [5], la cromatografía en capa fina (CCF) sobre gel de sílica [6-8], la separación mediante extracción en fase sólida (EFS) [9] y la extracción con solventes a partir de métodos reconocidos [10, 11].

A partir de la fracción extraída se lleva a cabo el análisis de las distintas subclases, para lo cual se han desarrollado diversos procedimientos descritos en varios trabajos de revisión [12-14].

El trabajo desarrollado consistió en la caracterización de los componentes lipídicos presentes en la materia prima activa (MPA) de la vacuna recombinante contra el virus de la hepatitis B, con el propósito de poder conocer finalmente las especies de lípidos que la conforman, determinar cada una cuantitativamente, y demostrar que no existen diferencias en la composición y el contenido de las subclases cuando se utiliza la MPA proveniente de dos plantas de producción que difieren en la instalación y en el personal.

Materiales y Métodos

Se analizaron 10 lotes de MPA (5 de cada planta de producción) que cumplían satisfactoriamente con las especificaciones de calidad. Ambos procesos emplearon la misma cepa de partida, así como los mismos protocolos durante el proceso, pero se diferenciaban en aspectos relacionados con la instalación y el personal que labora en ambas plantas. La nueva planta se denominará B y la planta donde se ha producido el HBsAg recombinante tradicionalmente se llamará C.

Se estudiaron dos métodos de extracción de amplia aplicación en diversos estudios que involucran la separación de fracciones lipídicas, como Folch [10] y Rosë-Gottlieb [11], y se compararon sus resultados a partir del perfil de ácidos grasos (AG) obtenido después de la derivatización de los extractos por medio de una reacción de esterificación y transesterificación con catálisis ácida, en presencia de exceso de metanol [15]. Se utilizó ácido sulfúrico 2% (v/v) en metanol a una temperatura de 85 ºC durante 90 min y luego se hicieron dos extracciones con 2 mL de hexano.

Se empleó un espectrómetro de masas modelo Jeol JMS DX-300 (Tokio, Japón) equipado con una columna capilar SP-2330 (Supelco, USA) de 15 m x 0,25 mm d.i. La temperatura del horno se programó entre 100 y 200 ºC con un incremento de 8 ºC/min. Como gas portador se utilizó helio a 0,8 mL/min y se inyectó 1 mL de muestra en modo split. Las condiciones de trabajo para el espectrómetro fueron: voltaje de ionización, 70 eV; temperatura de la fuente iónica, 250 ºC; rango de barrido 30-500 unidades de masa y una relación de split de aproximadamente 10:1.

Las diferentes especies de lípidos se determinaron mediante CCF. Se utilizaron placas de vidrio de 20 cm x 20 cm recubiertas con una capa de 0,25 mm de gel de sílica 60 como soporte cromatográfico. Se aplicaron 50 mL de muestra obtenida a partir del extracto orgánico del paso final de extracción, el cual fue secado primero casi completamente mediante el uso de nitrógeno gaseoso y resuspendido en 100 mL de hexano.

La aplicación se realizó en forma de una banda de 5 mm y se empleó un sistema ternario de solventes como eluente para desarrollar una corrida lineal. El sistema de solvente estaba formado por éter de petróleo 40-60º, éter dietílico y ácido acético glacial (80:20:2). Tanto la aplicación de la muestra como la parada del frente del solvente se realizó a 1,5 cm de los bordes inferior y superior de la placa.

Una vez aplicada la muestra, la placa se introdujo en una cubeta adecuada previamente equilibrada durante 1 h con la mezcla de solventes. Una vez que el frente de corrida llegó a la altura prevista, se extrajo la placa, se dejó secar durante 5 min y se aplicó el reactivo revelador de fluoresceína sódica 0,01% en metanol anhidro. Seguidamente, se colocó en una cámara oscura con una fuente de luz ultravioleta con rango de longitudes de onda entre 254 y 366 nm.

La determinación cuantitativa de cada especie se realizó a partir de un extracto lipídico y conllevó el empleo de diversos métodos, entre los que se encuentran algunos específicos que emplean determinaciones enzimáticas y otros menos específicos. La determinación del contenido de lípidos totales se realizó por el método de la sulfofosfovainillina [16]. Los fosfolípidos (PL) se cuantificaron a través de reacciones específicas del ión fosfato en solución: se realizó la determinación como fosfato inorgánico y el resultado se expresó como PL [17]. El colesterol (C) se determinó de acuerdo al procedimiento colorimétrico descrito por Sobel y Fernández [18], que permite cuantificar tanto el colesterol libre como el que se encuentra esterificado (EC). El método seleccionado para el estudio de los triglicéridos (TG) consiste en una modificación del que desarrolló McGowan [19], en el cual los TG son hidrolizados por una lipasa y producen glicerol y ácidos grasos no esterificados (AGNE). Esta determinación se llevó a cabo con el juego de reactivos GPO TRINDER (Sigma, EUA), mientras que para los AGNE se empleó el juego de reactivos NEFA-C (WAKO, Japón).

La composición lipídica obtenida para ambos procesos se comparó por medio de un análisis de varianza (ANOVA), con el empleo del paquete estadístico del programa Microsoft Excel 97 (Microsoft® Corporation, E.U.A).

Resultados y Discusión

Metodología para la extracción, identificación y cuantificación de las subclases de lípidos

Se desarrolló una metodología general de trabajo que comprendió tres aspectos fundamentales. En primer lugar, la extracción de la fracción lipídica para realizar los demás estudios a partir de este extracto. Después de la extracción se procede a la identificación de las subclases de lípidos por medio de CCF, lo que permite conocer los diferentes tipos de lípidos presentes en la muestra de interés. Este paso se empleó para poder tomar cada mancha y colectarla una vez separadas las subclases, posteriormente derivatizar los lípidos y obtener el éster metílico de los AG correspondientes, y conocer el perfil de estos AG para cada subclase de lípidos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (datos no mostrados), al igual que el perfil de AG de cada MPA cuando se lleva a cabo el análisis del extracto lipídico completo.

Con el empleo del extracto se procede a determinar cuantitativamente el contenido de cada una de las especies de lípidos encontradas mediante el análisis cualitativo por CCF. Con este fin, fue necesario montar y estandarizar 4 métodos para analizar las diferentes subclases de lípidos. Los parámetros estudiados para cada uno de los métodos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Parámetros estudiados en la estandarización de los métodos cuantitativos.

Parámetros / métodos	Colesterol	Fosfolípidos	AGNE	Triglicéridos
Exactitud (%)	100	99	98	101
Precisión (CV %)	3,3	6,5	1,6	1,2
Coef. de correlación	0,999	0,996	0,999	0,999
Límite de detección (µg)	1,2	4,0	0,5	0,7
Límite de cuantificación (µg)	4,0	16,0	1,6	2,2

Extracción de la fracción lipídica. Para llevar a cabo el análisis de las diferentes especies de lípidos presentes, se realizaron extracciones líquido-líquido según el procedimiento de Rosë-Gottlieb [11] y se compararon los resultados con los de la extracción por el método de Folch [10], teniendo en cuenta el perfil de AG de cada extracto. Con este fin se emplearon dos lotes de MPA (B1 y C5) provenientes de cada una de las producciones, y se aplicó cada método por duplicado para ambas muestras.

Cada uno de los extractos orgánicos se concentró por evaporación en corriente de nitrógeno gaseoso casi hasta la sequedad, y a continuación se derivatizaron, extrajeron y analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.

Los valores que aparecen en la Tabla 2 muestran que, en su mayoría, los perfiles obtenidos no difieren entre sí en más de 5% para los AG más abundantes, mientras que para los AG minoritarios las diferencias son algo superiores a este valor sin que haya diferencias significativas en el perfil de AG que se obtiene por ambas variantes de extracción (p > 0,05).

Tabla 2. Resultados comparativos del perfil de ácidos grasos empleando dos métodos de extracción. Los valores que se reportan para ambos métodos de extracción están expresados en por ciento relativo.

Método	C16:0	C16:1	C17:0	C17:1	C18:0	C18:1	C18:2
Rosë-Gottlieb	11,30	2,43	0,79	3,20	3,03	71,53	7,73
Folch	11,37	2,25	0,85	3,12	3,15	71,72	7,53
Diferencia (%)	0,6	8,0	7,1	2,5	5,0	0,3	2,6

Los resultados obtenidos son el promedio de 4 determinaciones (2 MPA de cada proceso).

Por esta razón, se decidió usar el método de Rosë-Gottlieb [11], que presenta como ventaja que la fracción de lípidos se extrae con una mezcla de éter y permanece en la fase superior, lo que facilita su separación, mientras que en la fase inferior quedan las proteínas precipitadas y los demás componentes acuosos pertenecientes a la matriz del producto, entre otros componentes.

En el caso del método de Folch [10], existe el inconveniente de que los lípidos se extraen con una mezcla clorofórmica y pasan a la fase inferior al igual que las proteína precipitadas, por lo que se requiere un paso de centrifugación adicional para lograr una mejor separación de la fracción de lípidos. Como resultado, hay una mayor manipulación, un mayor tiempo de duración del ensayo y dificultad en el procesamiento de varias muestras a la vez, lo que contribuye de conjunto a incrementar las posibilidades de afectar el resultado final.

Determinación de las diferentes subclases de lípidos. La presencia de zonas oscuras (violeta oscuro) sobre un fondo fluorescente, es señal de la existencia de las diferentes especies de lípidos (Figura 1, placas B y C).

Las separaciones que se obtienen concuerdan en gran medida con las reportadas en un estudio sobre aceites de semillas de diversos granos [20] (Figura 1, placa A), con el empleo de una mezcla de solventes con características de composición y polaridad muy semejantes a las utilizadas en este trabajo (hexano-éter dietílico-ácido fórmico [80:20:2]). A cada una de esas manchas se le asignó la especie que correspondía con el esquema anterior y se pudo determinar que la MPA del HBsAg presentaba 6 subclases de lípidos: fosfolípidos (0), monoglicéridos (0,06), diglicéridos (0,18), ácidos grasos libres no esterificados (0,56), triglicéridos (0,75) y ésteres de colesterol (0,93).

Figura 1. Representación esquemática de la separación de las subclases de lípidos para cada proceso (B y C) y su comparación con lo reportado por Christie [20] (A) y con los patrones de colesterol y ácidos grasos libres (Ref).

Los valores de movilidad relativa (Rf) obtenidos para dos patrones de colesterol (0,22) y de ácidos grasos libres (0,57) corroboran el resultado anterior. Si bien asignar la mancha de mayor Rf como éster de colesterol pudiera ser contradictorio dada la posibilidad de comigración de otros componentes de baja polaridad y la ausencia de una banda de colesterol libre, hay dos factores que confirman esta asignación. En primer lugar, la determinación cuantitativa de colesterol según el método de Sobel y Fernández [18], que permite cuantificar tanto el colesterol libre como el esterificado, muestra que hay colesterol en la molécula de MPA. Al estar ausente el colesterol en su forma libre, sólo queda la posibilidad de la forma esterificada. En segundo lugar, la MPA posee una alta homología con el antígeno natural y para este último se ha reportado la presencia de ésteres de colesterol [21].

Cuantificación del contenido de lípidos totales y de las diferentes subclases. Cada uno de los 10 lotes fue analizado para determinar el contenido de los diferentes tipos de lípidos, así como para corroborar que la suma de todas estas subclases no presentaba diferencias significativas en relación con el contenido total de lípidos determinado por el método colorimétrico.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3. Se puede apreciar que la composición de los principales componentes coincide en gran medida con la reportada por Gavilanes y colaboradores [21] para el antígeno natural. La MPA posee los tres principales componentes lipídicos del antígeno natural (fosfolípidos, triglicéridos y ésteres de colesterol), y el contenido y la relación del componente mayoritario (fosfolípidos) coincide en un grado elevado en ambos procesos (71 y 64% respectivamente para las muestras C y B, y 67% para el antígeno natural).

Tabla 3. Valores obtenidos para cada subclase, los cuales están expresados en µg por cada 20 µg de proteína.

Lotes	Lípidos. totales (Colorimét.)	C (FeCl3)	TGs (enzimát.)	AGNEs (enzimát.)	PL (Fosfatos)
B1	14,9	0,20	2,3	0,7	8,2
B2	19,5	0,26	2,1	0,7	12,1
B3	16,5	0,19	4,2	1,0	10,0
B4	20,5	0,17	4,8	1,2	11,6
B5	23,4	0,17	2,7	0,9	18,5
C1	23,2	0,13	5,5	1,1	16,2
C2	18,7	0,13	3,7	1,1	10,2
C3	15,7	0,22	4,4	1,4	14,6
C4	19,3	0,14	4,2	1,6	12,3
C5	19,2	0,10	3,4	0,8	15,2

Esta similitud entre ambos antígenos se observó también en los resultados obtenidos para la composición de los principales ésteres metílicos de los AG presentes [22].

Los resultados en cuanto a la composición de los ésteres metílicos de los AG, son similares a los reportados por Gavilanes y colaboradores [21].para las tres especies principales encontradas. En cuanto a su relación porcentual, se reportó C_18:2 > C_16:0 > C_18:1, mientras que el HBsAg recombinante presenta C_18:1 > C_18:2 > C_16:0. Este hecho es favorable en cuanto a homología del producto recombinante con el producto natural, y, además, tiene la ventaja de que el por ciento de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) es menor . por debajo de 20%. La disminución del contenido de AGPI incide en una mayor estabilidad de la MPA porque los ácidos grasos como el ácido linólico tienen mayor posibilidad de oxidación mediante su reacción por el doble enlace, por lo que constituye otra vía para explicar la elevada estabilidad de la MPA en diferentes condiciones de almacenamiento (18 meses a 4 ºC y 9 meses a 28 ºC) [23].

Estos resultados relacionados con la similitud de ambos antígenos, corroboran lo planteado por Muzio [24] acerca de que las moléculas de HBsAg producidas por distintos hospederos se ensamblan para formar partículas morfológica y antigénicamente similares a la partícula natural, aun cuando los componentes lipídicos no sean exactamente iguales.

Se realizó un análisis de varianza para ambos procesos (Tabla 4) y se pudo concluir que no existen diferencias significativas entre ambas varianzas. Para todos los casos se obtuvieron valores de p > 0,05, con lo que se demostró que la variación entre los lotes no es significativa y que hay consistencia en la composición de lípidos para los procesos de producción desarrollados en las dos plantas de producción.

Tabla 4. Resultados del ANOVA realizado a las subclases obtenidas por ambos procesos.

Subclase	Proceso B (Media ± DE)	Proceso C (Media ± DE)	p
Triglicéridos	3,3 ± 1,2	4,2 ± 0,8	0,16
AGNE	0,9 ± 0,2	1,2 ± 0,3	0,09
Colesterol	0,14 ± 0,04	0,20 ± 0,04	0,07
Fosfolípidos	12,1 ± 3,9	13,7 ± 2,4	0,44
Lípidos totales©	19,0 ± 3,4	19,2 ± 2,7	0,89
Lípidos totales(s)	16,1 ± 4,0	19,3 ± 2,9	0,23

Los valores se expresan en µg por cada 20 µg de HBsAg. ^©Obtenido por el método colorimétrico. ^(s)Obtenido a través
de la suma de las cuatro especies independientes.

Finalmente, el contenido medio expresado en por ciento para cada subclase de lípido en relación con su concentración total, se muestra en la Tabla 5. En ambos casos se obtuvieron resultados satisfactorios, pues se lograron por cientos superiores a 80% (87% para el proceso B y 100% para el proceso C).

Tabla 5. Contenido en por ciento obtenido para cada subclase en las dos instalaciones estudiadas.

Subclase	Proceso B	Proceso C
Triglicéridos	17	22
AGNE	5	6
Colesterol	1	1
Fosfolípidos	64	71
Total	87	100

Los valores se calcularon en relación con contenido de lípidos totales determinado por el método colorimétrico.

Conclusiones

Con la aplicación de un conjunto de procedimientos, se determinó la composición lipídica del HBsAg producido en dos instalaciones diferentes y se confirmó la presencia de fosfolípidos; mono, di y triglicéridos; ácidos grasos libres o no esterificados y ésteres de colesterol. Por medio del estudio comparativo de 5 lotes provenientes de ambos procesos, se pudo demostrar que no se afecta significativamente el perfil lipídico del antígeno recombinante, y se encontró una gran similitud en cuanto a la composición lipídica del antígeno recombinante y el antígeno natural.

Los resultados permiten concluir que es posible emplear ambas instalaciones para desarrollar procesos de producción de HBsAg, y que la nueva instalación no afecta el perfil característico del antígeno recombinante.

Referencias

1. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Technical Reports Series 1989;786:40–3.

2. Gavilanes F, Gómez-Gutiérrez J, Aracil M, González-Ros JM, Feragut JA, Peterson DL. Hepatitis B surface antigen. Role of lipids in maintaining the structural properties of protein component. Biochem J 1990;265:857–64.

3. Valenzuela P, Coit D, Halleweil R, Heberlein U, Laub O, Medina A, et al. Structure of Hepatitis B antigens and their synthesis and assembly in heterologous systems. Medical Virology III. Peterson and de la Maza, editors. Elsevier Science Publishing; 1984.

4. Peterson DL. Isolation and characterization of the major protein and glycoprotein of Hepatitis B surface antigen. J Biol Chem 1981;256:6975–83.

5. Ingalls ST, Kriaris MS, Xu Y, Dewulf DW, Tserng KY, Hoppel CL. Method for isolation of non-esterified fatty acids and several other classes of plasma lipids by column chromatography on silica gel. Journal of Chromatography 1993;619:9–19.

6. Sattler W, Reicher H, Ramos P, Panzenboeck U, Hayn M, Esterbauer H, et al. Preparation of fatty acid methyl esters from lipoprotein and macrophage lipid subclasses on thin layer plates. Lipids 1996; 31(12):1301–10.

7. Touchstone CJ. Thin-layer chromatographic procedure for lipid separation. Journal of Chromatography B 1995;671: 169–95.

8. Cserhát T, Forgács E. Trends in thin layer chromatography. Journal of Chromatographic Science August 1997; 35:383–91.

9. Christie WW. Solid phase extraction columns in the analysis of lipids. The Oily Press Dundee 1992:1–18.

10. Folch J, Less M, Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J Biol Chem 1956;226:497–506.

11. International Dairy Federation Standard 1C 1987; Milk: Determination of fat content-Röse Gottlieb method.

12. Christie WW. Chromatographic analysis of phospholipids. Z Lebennsm Unter Forsch 1985;181:171–82.

13. Hoving EB. Chromatographic methods in the analysis of cholesterol and related lipids. Journal of Chromatography B 1995;671:341–62.

14. Ruiz-Gutierrez V, Barron LJ. Methods for the analysis of triacylglycerols. Journal of Chromatography B 1995;671:133–68.

15. Gutnikov G. Fatty acid profiles of lipid samples. Journal Chromatography B 1995;671:71–89.

16. Woodman DD, Price CP. Estimation of serum total lipids. Clin Chem Acta 1972; 38:39–43.

17. Clescere L, Green Birg A, Truesell R. Standard methods for examination of water and wastewater. 17th ed. USA: Am Pub Health Assoc, Am Water Work Assoc, Am Water Pollut Control Assoc; 1989.

18. Sobel C, Fernández A. Determination of total and esterified cholesterol in serum. Clin Chem 1996;12(11):739–47.

19. McGowan MW, Artist J, Zak B. A peroxidase-couple method for the colorimetric determinations of serum triglycerides. Clin Chem 1983;29:538–40.

20. Christie WW. Gas chromatography and lipids. A practical guide. The Oily Press 1989:29–30.

21. Gavilanes F, Gonzalez-Ros JM, Peterson DL. Structure of Hepatitis B surface antigen. Characterization of the lipid components and their association with the viral proteins. Journal of Biological Chemistry 1982;13: 7770–7.

22. Marcelo JL, Hormaza JV, Rosado A, Padrón G. Perfil de ácidos grasos por CG/EM del antígeno recombinante de superficie de la hepatitis B (en preparación).

23. Vega M, Currás T, Izquierdo M, Marcelo JL, García G, Rodríguez O, et al. Estabilidad térmica de la vacuna cubana recombinante anti-hepatitis B. VacciMonitor 1997;5:4–8.

24. Muzio V. Obtención de una cepa recombinante de Pichia pastoris productora del antígeno de superficie viral para la elaboración de la vacuna cubana anti-hepatitis B (Tesis Doctorado);UH:1995.

Copyright Elfos Scientiae 2001

The following images related to this document are available:

Line drawing images