Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 18, Num. 2, 2001, pp. 85-87

Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp.85-87

Code Number: BA01012

RESUMEN

Se liofilizaron tres cepas mutantes de micobacterias biotransformadoras de esteroles para producir precursores esteroides de interés para la industria médico-farmacéutica (Mycobacterium sp. NRRL B-3683, NRRL B-3805 y MB-3805). Se utilizaron los medios de liofilización siguientes: leche descremada (10%) y leche descremada (5%) mezclada con glutamato de sodio (5%). La liofilización se realizó a una temperatura de congelación de -196 ºC, se hizo el secado primario durante 18 h manteniendo la temperatura del producto por debajo de -20 ºC y el secado secundario durante 5 h a 20 ºC. Dos grupos de ámpulas por cepa y por variante se mantuvieron por 10 años, unas en refrigeración (8 ºC ± 2 ºC) y otras a temperatura ambiente. Se evaluó la viabilidad de las cepas y la capacidad de producir androstendiona (AD) y/o androstadiendiona (ADD). Se observó que la supervivencia varió entre 14% y 55,2% en dependencia de la cepa y de las condiciones de liofilización y mantenimiento. Además, la capacidad biotransformadora no se afectó, lo que constituye el aspecto más importante de estas cepas.

Palabras claves: biotransformación de esteroles, liofilización, micobacterias

ABSTRACT

Three Steroidal Precursor-producing Mutants of Mycobacteria Preservated by Freeze-drying During Ten Years. Three mutants of Mycobacterium sp. employed in biotransformation of sterols for the pharmaceutical industry (NRRL B-3683, NRRL B-3805 and MB-3805) were freeze-dried, vacuum-sealed and stored for 10 years at room and 8 ºC ± 2 ºC temperatures. The formulations for freeze-drying were skim milk 10% or skim milk 5% plus sodium glutamate 5%. The freezing temperature was -196 ºC, the primary drying was carried out for 18 h at a product temperature of -20 ºC and the secondary drying was carried out at 20 ºC for 5 h. Two groups of ampoules were conserved 10 years, one of them at 8 ºC ± 2 ºC and the other at room temperature. The viability of the microorganisms varied from 14% to 55.2% depending on the formulation and the storage temperature. The ability of producing androstenedione (AD) and/or androstadienedione (ADD) during biotransformation of sterols, was not affected.

Keywords: biotransformation of sterols, freeze-drying, mycobacteria

Introducción

La liofilización es un método muy utilizado para conservar microorganismos. Sin embargo, algunas bacterias son sensibles a esta técnica porque los niveles de supervivencia disminuyen significativamente después de ser sometidas a este proceso, e incluso su mantenimiento prolongado hace que la viabilidad celular disminuya aún más. Tal es el caso de las especies del género Mycobacterium [1].

Se conoce que algunos factores pueden afectar la viabilidad de los microorganismos liofilizados, entre los que se citan la naturaleza de la cepa, las condiciones de cultivo, la fase de crecimiento, la concentración celular, la formulación de los medios protectores contra la liofilización, los parámetros de la liofilización y el modo de rehidratación [2].

Uno de los aspectos más importantes es la formulación adecuada para realizar la liofilización, lo cual determina las características termofísicas del sistema y minimiza la muerte celular, tanto durante la congelación como durante la sublimación, la desorción y el almacenamiento prolongado. Este aspecto no siempre se ha reportado en la literatura y, por tanto, es necesario seleccionarlo teniendo en cuenta que cada cepa microbiana tiene sus propias características.

Existen sustancias que se utilizan comúnmente con buenos resultados como protectores en la liofilización de bacterias. Estos compuestos son la leche descremada [2-4], las peptonas [2], el glutamato de sodio [2, 5, 6], los azúcares [5-9] y otros.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la conservación por liofilización a largo plazo de tres cepas mutantes de micobacterias capaces de biotransformar el colesterol y otros esteroles para producir precursores esteroides de interés farmacéutico; por ejemplo, la androstendiona (AD) y la androstadiendiona (ADD). Con ese fin, se utilizaron dos variantes de medio de liofilización y dos variantes de almacenamiento.

Materiales y Métodos

Microorganismos

Se utilizaron las cepas Mycobacterium sp. NRRL B-3683, NRRL B-3805 y MB-3805 que fueron donadas por la Universidad de Columbia Británica, Canadá. Estos mutantes biotransforman el colesterol y otros esteroles y producen androstendiona (AD) y/o androstadiendiona (ADD) [10-12].

Condiciones de liofilización

Las bacterias se propagaron en el medio de Conner y colaboradores. [13] a 30 ºC, 200 rpm (zaranda orbital Mod. Zot-1, CNIC, Cuba), y una concentración celular media de 1010 ufc/mL, durante 96 h. El cultivo se centrifugó a 5 000 xg por 10 min y se lavó dos veces con agua destilada estéril. La biomasa se resuspendió y homogeneizó en 10 mL de las siguientes variantes de medios protectores: leche descremada 10% (Merck, Alemania) y leche descremada 5% con glutamato de sodio 5% (Merck, Alemania). En ese momento se determinó la concentración celular inicial. De cada suspensión se tomaron alícuotas de 0,2 mL que se introdujeron en ámpulas estériles provistas de una torunda de algodón estéril en su parte superior. Para la liofilización se utilizó una liofilizadora RP1,5 (SERAIL, Francia), una temperatura de congelación de -196 ºC (N2 líquido), secado primario durante 18 h a una temperatura del producto por debajo de -20 ºC y secado secundario durante 5 h a 20 ºC. Las ámpulas se sellaron al vacío y se almacenaron durante 10 años en condiciones diferentes, unas a temperatura ambiente y otras en refrigeración (8 ºC ± 2 ºC).

Determinación de la viabilidad

Para determinar la concentración celular, se utilizaron tres ámpulas en todos las casos inmediatamente después de la liofilización y al cabo de los 10 años de almacenamiento. Después de abrir las ámpulas, el contenido se rehidrató con 0,2 mL de agua destilada estéril, se dejó en reposo por 15 min, y el crecimiento se determinó mediante diluciones seriadas y sembrado en placas Petri que contenían agar nutriente.

Biotransformación

Una vez obtenidas las colonias separadas, se prepararon cultivos a partir de ellas en el medio de Conner y colaboradores [13] y se incubaron a 30 ºC durante 16 a 18 h a 200 rpm. Posteriormente se realizó el inóculo en el mismo medio con una DO590 inicial igual a 1 y se incubó a 30 ºC y 200 rpm por 48 h. La biotransformación se produjo en el mismo medio de cultivo y se inoculó a una DO590 inicial igual a 1. El colesterol se preparó según Borrego y colaboradores [14] y se adicionó a los cultivos en condiciones asépticas. Los cultivos se incubaron a 30 ºC y 200 rpm durante 6 días y posteriormente se esterilizaron.

Determinación de AD y/o ADD

Se hicieron 4 extraciones con acetato de etilo (4 x 100 mL) a cada cultivo. Los cultivos productores de AD se acidificaron previamente hasta pH 2 con HCL (3 mol/L). La determinación de AD y ADD se realizó mediante HPLC en una columna de fase reversa RP-18 de 5 mm (125 x 4) (Merck, Alemania) con el empleo de un detector UV a 254 nm. El sistema de solventes que se empleó fue una mezcla de agua-metanol 35:65 y se aplicó un flujo de 1,5 mL/min. Se utilizó 17a-metiltestosterona como patrón interno [14, 15].

Análisis estadístico

Todas las determinaciones de viabilidad se realizaron a partir de tres ámpulas por variante y la biotransformación se evaluó por triplicado. El análisis estadístico para cada cepa se realizó a través de la prueba t de Student o ANOVA-1, y la prueba de comparación de medias de Duncan [16].

Resultados y Discusión

Cuando se analizó la influencia del medio protector en la liofilización (Tabla 1), se pudo apreciar que la leche descremada junto con el glutamato de sodio protegieron adecuadamente a los mutantes estudiados. Este efecto es muy evidente en las cepas B-3683 y B-3805, para las cuales se obtuvieron diferencias significativas comparado con la leche descremada 10%, para una probabilidad de 95%. A pesar de este resultado, los niveles de viabilidad después de la liofilización permanecieron elevados, en un orden de 108  ufc/mL para todas las cepas.

Tabla 1. Efecto de la liofilización en la viabilidad de las cepas mutantes de Mycobacterium sp. en dos medios protectores.

Variante	NRRL	B-3683		NRRL	B-3805			MB-3805
	ufc/mL antes	ufc/mL después	D S	ufc/mL antes	ufc/mL después	D S	ufc/mL antes	ufc/mL después	D S
1	1,0 x 1010	3,2 x 108	1,50 ± 0,5*	1,2 x 1010	4,9 x 108	1,38 ± 0,2* *	3,0 x 1010	5,1 x 108	1,78 ± 0,7
2	1,6 x 1010	2,5 x 108	1,81 ± 0,7	2,2 x 1010	3,4 x 108	1,81 ± 0,6	3,4 x 1010	5,2 x 108	1,82 ± 0,8

1, leche descremada (10%); 2, leche descremada (5%) + glutamato de sodio (5%); D S, log C_i – log C_f; C_i, ufc/mL antes de la liofilización; C_f, ufc/mL después de la liofilización; * , diferencias significativas, t_calculada = 7,79, g_L = 10 (prueba t de Student, probabilidad 95%); * * , diferencias significativas, t_calculada = 7,52, g_L = 10 (prueba t de Student, probabilidad 95%).

Tanto la leche descremada [3, 4] como el glutamato de sodio [6] han sido utilizados con buenos resultados de forma independiente como medios protectores en la liofilización de especies de micobacterias. Sin embargo, la combinación de estas dos sustancias proporciona mejores resultados que la leche descremada solamente para las cepas estudiadas.

Al analizar el efecto de las dos formulaciones de medios protectores y de las formas de almacenamiento sobre la supervivencia (%) de las tres cepas mutantes de Mycobacterium liofilizadas que fueron almacenadas por 10 años (Tabla 2), se pudo observar una pérdida de la viabilidad después de liofilizadas con respecto a la hora cero. Esta variación depende más del tipo de almacenamiento a que fueron sometidas las cepas que de la formulación utilizada. Se observó que si bien la formulación no influyó notablemente en la supervivencia de las cepas conservadas en frío, su influencia fue determinante cuando se almacenaron a temperatura ambiente.

Tabla 2. Influencia del almacenamiento en la viabilidad de las cepas mutantes de Mycobacterium sp. liofilizadas
en dos medios protectores.

Variante	NRRL	B-3683		NRRL	B-3805			MB-3805
	ufc/mL horaa 0	ufc/mL 10 años	Supervivencia (%)	ufc/mL horaa 0	ufc/mL 10 años	Supervivencia (%)	ufc/mL horaa 0	ufc/mL 10 años	Supervivencia (%)
1	1,5 x 108	6,0 x 107	40,0 ± 3,2 (a)	5,0 x 108	1,5 x 108	30,0 ± 2,0 (a)	5,3 x 108	2,5 x 108	47,2 ± 2,5 (a)
2	4,9 x 108	1,4 x 108	28,6 ± 2,1 (b)	4,8 x 108	3,9 x 107	8,1 ± 1,8 (b)	4,9 x 108	8,9 x 107	42,6 ± 3,2 (a)
3	5,1 x 108	2,2 x 108	43,1 ± 1,5 (a)	3,4 x 108	8,5 x 107	25,0 ± 2,0 (a)	5,3 x 108	2,9 x 108	55,2 ± 2,3 (a)
4	1,0 x 107	1,4 x 106	14,0 ± 2,8 (c)	3,0 x 108	2,3 x 107	7,7 ± 1,7 (b)	5,0 x 108	7,0 x 107	14,0 ± 3,6 (b)

1, leche descremada (10%); refrigeradas; 2, leche descremada (10%); medio ambiente; 3, leche descremada (5%) + glutamato de sodio (5%), refrigeradas; 4, leche descremada (5%) + glutamato de sodio (5%), medio ambiente; ^a, hora cero después de liofilizadas las cepas. Nota: Distribución normal de datos. Letras diferentes a (a) indican diferencias significativas
según la prueba de Duncan (p £ 0,05).

El empleo del glutamato de sodio con leche descremada proporcionó una buena protección celular, al igual que el uso de leche descremada, puesto que no se detectaron diferencias significativas en la supervivencia microbiana entre estas dos variantes para las mismas condiciones de almacenamiento. Este resultado corrobora lo que han citado otros autores en relación con el hecho de que el glutamato de sodio brinda buena protección a otras especies de micobacterias y a otros gérenos bacterianos [1, 17, 18]. Es necesario señalar que si bien las cepas perdieron viabilidad durante el almacenamiento, ésta es elevada aún pues al cabo de 10 años osciló entre 106 y 108 ufc/mL.

En general, las cepas que se almacenaron a temperatura ambiente tuvieron una pérdida considerable de la viabilidad en relación con aquellas que se conservaron en refrigeración. Estos resultados se han reportado para otros microorganismos [19, 20]. Para el género Mycobacterium se ha reportado que este tipo de almacenamiento puede causar pérdidas considerables de la viabilidad después de un mes, por lo que se recomienda el empleo la refrigeración en este proceso [1]. Contrario a lo planteado en la literatura, el presente trabajo demostró que para un período tan prolongado como 10 años, la afectación a temperatura ambiente fue inferior a un orden logarítmico en todos los casos. Es posible que estas cepas sean más resistentes que otras especies de micobacterias, principalmente especies patógenas, pues son mutantes que se obtuvieron de cepas salvajes aisladas del suelo que deben poseer mayor resistencia a temperaturas ambientales más altas.

En relación con la capacidad biotransformadora de los mutantes (Tabla 3), se puede apreciar que a pesar de que todas no produjeron el mismo precursor esteroide como producto mayoritario, no existieron diferencias significativas entre los rendimientos de las variantes liofilizadas y los controles, lo que demuestra que la actividad fundamental de los mutantes no se perdió a pesar de las variaciones que se detectaron en la supervivencia celular.

Tabla 3. Capacidad de las cepas mutantes de Mycobacterium para biotransformar el colesterol después de 10 años de liofilizadas.

Variante	NRRL	B-3683	NRRL	B-3805	M	B-3805
	YAD (%)	YADD (%)	YAD (%)	YADD (%)	YAD (%)	YADD (%)
1	0,4	17,4	15,5	0,3	14,3	0,5
2	0,6	16,1	14,5	0,4	14,8	0,3
3	nd	15,4	15,2	0,5	15,1	0,3
4	nd	15,6	14,8	0,2	15,4	0,4
Control*	0,3	17,6	15,0	0,4	15,2	0,4

Y_{AD o ADD}, (mg de AD o ADD obtenido/mg de colesterol adicionado) x 100; 1, leche descremada (10%), refrigerada; 2, leche descremada (10%), medio ambiente; 3, leche descremada (5%), + glutamato de sodio (5%), refrigerada; 4, leche descremada (5%) + glutamato de sodio (5%), medio ambiente. nd, no se detectó el compuesto; *, se utilizó un cultivo fresco.

Conclusiones

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