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Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No, 2, April 2001, pp. 95-96
Omar López Ocejo, Mónica Bequet Romero, Patricia Hernández Casañas,
Manuel J Araña Rozains, Silvio E Perea Rodríguez, Pedro López Saura
Code Number: BA01015 Introducción La habilidad de los tumores para inducir y sostener el proceso angiogénico se atribuye a dos cambios funcionales fundamentales. El primero es un evento de pérdida de función, que implica la pérdida o regulación negativa de proteínas inhibitorias endógenas tales como Trombospondina-1 (TSP1) e IFNa. El segundo cambio es un evento de ganancia de función en el cual los factores de crecimiento conocidos como estimuladores de la angiogénesis son inducidos. Ejemplos de tales estimuladores incluyen bFGF, IL-8, TGFb, y el TNFa, que actúan de manera indirecta, además del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) que activa de manera directa y específica el endotelio vascular. Es precisamente en el VEGF que se han centrado la mayoría de los esfuerzos dedicados a la supresión de la angiogénesis tumoral, ya que se sobreexpresa en la mayor parte de los tumores ligada al cambio al fenotipo angiogénico. El presente trabajo estudia el fenómeno angiogénico en el cáncer cervical asociado al virus del papiloma humano (HPV), primeramente desde una óptica global, analizando la expresión de los moduladores más relevantes del proceso, y posteriormente, se centra en la búsqueda del elemento inductor del VEGF en este sistema. Para concluir se analiza la potencialidad de un esquema de bajas dosis y tratamiento prolongado con IFNa, para revertir el fenotipo angiogénico en células HeLa. Inducción de activadores y represión de inhibidores de la angiogénesis en líneas celulares positivas para las oncoproteínas del HPV-16 Aunque varios estudios recientes reflejan los niveles de factores angiogénicos en el suero de pacientes, las células secretoras de los mismos resultaban desconocidas. En el presente trabajo se evaluó la capacidad secretora de factores angiogénicos tumorales (TAF) por las células HPV-16+ y HPV-18+, analizándose, a nivel molecular, la identidad y el nivel de expresión de estos factores. • Al tratar células endoteliales (HUVEC) con el medio condicionado por células HPV16+ en ausencia de otros mitógenos, se demostró que la presencia del genoma viral condiciona la expresión de una actividad proangiogénica hacia el medio de cultivo. • A nivel molecular (Northern blot) se determinó el grado de expresión de algunos de los moduladores de la proliferación endotelial expresados en células HPV-16 +. El análisis integral de estos resultados evidenció un aumento significativo en la expresión de las moléculas proangiogénicas y una disminución en el caso de las antiangiogénicas (Tabla). Tabla. Expresión de los transcriptos de moduladores de la angiogénesis. Para los factores proangiogénicos se tomó como valor basal el de las células RHEK, mientras que en el caso de las TSP los valores se refieren a C33-A.
• El análisis del transcripto del VEGF en células HeLa (HPV-18+) demostró que el efecto sobre la transcripción de este gen no depende del subtipo viral. La determinación por ELISA de la proteína (VEGF) en el medio condicionado por estas células demostró que el aumento en los niveles de mRNA se traduce en un incremento en los niveles de proteína secretada. • Un análisis por RT-PCR de las isoformas del VEGF demostró que todas se encuentran sobre-expresadas en células HPV-16+. Al igual que para cáncer de colon se demostró que existe un incremento mucho más significativo en los niveles de mRNA de VEGF189 que resultaron 30 veces superiores a los hallados en HaCaT. Desarrollo de un nuevo modelo murino que permite el estudio de la tumorigénesis asociada a HPV-16 Debido a la especificidad de especie del HPV los modelos que existían para evaluar la tumorigénesis asociada a este virus se restringían a ratones desnudos. Como parte de este trabajo se obtuvo un transfectante estable (3T3-16) para el genoma del HPV-16 a partir de una línea de fibroblastos murinos (3T3) de origen BALB/C. · El análisis del fenotipo tumoral de la línea celular transformada por HPV-16, demostró que la inoculación de las mismas origina tumores en ratones BALB/C con características histopatológicas similares a las que presentan las lesiones cervicales asociadas a HPV-16. La densidad y la distribución alterada de la vasculatura en los tumores murinos reprodujo la morfología angiogénica de las lesiones premalignas de alto grado y del cáncer cervical humano. · El estudio de la expresión del gen del VEGF por Northern blot evidenció un aumento significativo de la expresión del mRNA de este gen en 3T3-16 respecto a la línea parental 3T3, lo que corroboró los resultados del análisis patológico respecto al grado de vascularización de los tumores. Estos datos, además, confirman la asociación entre la expresión del VEGF y la transformación maligna por HPV-16. Los oncogenes y la angiogénesis tumoral: la oncoproteína E6 del HPV activa el promotor del gen del VEGF independiente de p53 Muchos son los trabajos que hasta ahora han tratado de explicar la base de la transformación maligna por HPV. La mayor parte de ellos se han enmarcado en el estudio de la actividad oncogénica de las proteínas tempranas codificadas por el genoma viral (E5, E6 y E7), teniendo en cuenta su influencia en la actividad de activadores de la transcripción y genes supresores de tumores (c-Jun, p53 y Rb entre otros). Otras alteraciones genéticas, además de la presencia del HPV pudieran contribuir a la patogénesis del cáncer cervical. Por ejemplo la mayoría de las displasias asociadas a HPV y a carcinomas cervicales expresan altos niveles de EGFR así como de su ligando (TGFa). · Utilizando anticuerpos monoclonales neutralizantes desarrollados contra el receptor de EGF (hR3 y C225) y contra su ligando TGFa (Ab-3), se comprobó que en células HeLa la sobre-regulación del VEGF a nivel proteico no involucra el lazo autocrino EGF-EGFR presente en estas células. · La co-transfección transiente en queratinocitos (HaCaT) y fibroblastos murinos (NIH3T3) de un plásmido que codifica la oncoproteína E6 del HPV-16 (pJ4W16E6) y una construcción reportera que incluye el promotor del VEGF (2.6 VEGF) acoplado al gen de la luciferasa, resultó en un incremento dosis-dependiente de la actividad del promotor del VEGF independientemente del tipo celular analizado. Este mismo análisis en fibroblastos knock-out para p53 (MEF p53-/-) demostró que la transactivación del promotor de VEGF por la oncoproteína E6 es independiente de su capacidad para inactivar p53. · Empleando mutantes de deleción del promotor del VEGF, se identificó una zona del mismo vinculada a su activación por la oncoproteína E6, que comprende la zona entre –194 y –50 pb relativo al sitio de inicio de la transcripción y donde se localizan 4 sitios consenso Sp1. El IFNa produce un deterioro del balance angiogénico y una supresión de la tumorigenicidad de las células HeLa Los IFNa son proteínas reguladoras con potentes actividades biológicas. El IFNa2 fue el primer inhibidor de angiogénesis usado en ensayos clínicos resultando efectivo en el tratamiento de hemangiomas de la infancia. En el caso del carcinoma cervical se conoce que el tratamiento de células HPV positivas con IFNa disminuye la expresión de los oncogenes virales; sin embargo, hasta ahora no se había descrito ningún efecto del mismo sobre moduladores del evento angiogénico. · El estudio del efecto de un tratamiento prolongado (1 año) de células HeLa con concentraciones bajas y sin efecto antiproliferativo (200 UI/mL) de IFNa natural y recombinante a-2b, demostró que ambas preparaciones de IFNa son capaces de suprimir completamente la tumorigenicidad evaluada en ratones desnudos inoculados por vía subcutánea con 2 x 106 células. Sin embargo, se demostró que este comportamiento no fue debido a alteraciones en el patrón del DNA viral y más bien las células tratadas aumentaron su resistencia a las células NK. · La investigación del efecto del IFNa sobre los mecanismos de inducción del evento angiogénico a nivel molecular, mostró un incremento de la expresión del mRNA del VEGF y un decrecimiento del bFGF, causando de esta manera un deterioro del balance angiogénico que pudiera justificar el cambio del fenotipo tumoral de las células HeLa tratadas con IFNa. Conclusiones El presente trabajo demuestra, primeramente, que la célula positiva
para el genoma del HPV-16 (HPV-16 +) sometida a condiciones de estrés reproduce
el patrón de inducción de citocinas y factores de crecimiento pro-angiogénicos
encontrados en suero de pacientes. En particular, los estudios acerca de la
inducción del VEGF en células HPV+ demostraron que este evento es independiente
del lazo autocrino EGFR-TGFa que se establece en este tipo celular. Además,
en experimentos de transfección transiente se demostró por primera vez que la
oncoproteína E6 (HPV-16) activa el promotor del gen del VEGF independientemente
de su efecto inhibidor sobre p53. Este resultado señala a la oncoproteína E6
como un blanco terapéutico importante para la disminución de la angiogénesis
en el carcinoma cervical. Por último, se analizó el efecto del IFNa, que fue
el primer farmaco utilizado como antiangiogénico en la clínica, sobre los mecanismos
de inducción del evento angiogénico en células HeLa (HPV-18), demostrándose
el potencial efecto sobre mediadores de la angiogénesis de dicha molécula en
el carcinoma cervical.
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