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Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp. 97-98
Niury Acosta Contreras, Alejandro Beldarraín Iznaga, Tirso Pons,
Glay Chinea, José A Cremata, Raquel Montesino, Marlene Mata, Daysi Barbería, Gustavo Furrazola, Gabriel Padrón, Gabriel Márquez, Ricardo Serrano
Code Number: BA01016 Introducción Como se conoce desde hace muchos años, una proteína requiere determinado grado de su estructura nativa para realizar eficazmente su función. Por esta razón, la caracterización físico-química para demostrar la estructura correspondiente a una proteína biológicamente activa, está incluida en las regulaciones vigentes para productos biológicos y biotecnológicos [1]. A esto se adiciona el interés de conocer la influencia de los factores externos en la estabilidad como una herramienta útil de diagnóstico en la evaluación de la integridad estructural. La combinación de técnicas espectroscópicas y calorimétricas constituye una metodología para la caracterización físico-química de proteínas obtenidas por recombinación genética. En este trabajo se presenta la primera caracterización de los parámetros que influyen en la estabilidad conformacional y el desarrollo de métodos para la elucidación del plegamiento de proteínas recombinantes obtenidas en el CIGB. Además, dichos métodos contribuyen a validar los métodos teóricos utilizados para predecir la estructura tridimensional de varias de estas proteínas. La combinación de la calorimetría diferencial de barrido, el dicroísmo circular, la fluorescencia y la RMN ha servido para evaluar la estabilidad conformacional de la invertasa expresada en Hansenula polymorpha y P. pastoris, de la proteasa aspártica y la dextranasa expresadas en Pichia pastoris, el rHu-IFN-g y la rSk expresadas en Escherichia coli, en función del pH y la fuerza iónica. Dextranasa [2] Dicroísmo circular. Se corroboró que el mayor por ciento de elementos de estructura secundaria son láminas b y que este porciento no se afecta en el rango de pH entre 5 y 7, ni por el proceso de desglicosilación. La combinación de diferentes métodos teóricos para la predicción de estructura tridimensional de proteínas y el método de dicroísmo circular, nos permitió proponer una estructura del tipo propela b para dicha enzima. Este modelo tridimensional constituyó la base para el diseño de mutaciones puntuales con el objetivo de estudiar el mecanismo catalítico de la enzima. Interferon gamma [3] Dicroísmo circular. Se demostró que la estructura de hélices a que caracteriza a esta proteína se ve afectada visiblemente con la composición del solvente en función del pH, la temperatura y la fuerza iónica. Calorimetría diferencial de barrido. Se demostró que la desnaturalización térmica es irreversible a concentraciones elevadas de tampón en el rango de pH 2-10, aunque se encontró que a pH 3,5-5,4 y baja fuerza iónica las transiciones calorimétricas son reversibles. La entalpía de desnaturalización DH(Tm), a la temperatura de desnaturalización Tm, fue una función de Tm y de la concentración del tampón, conllevando a la disminución de la capacidad calorífica con la concentración del tampón. Fluorescencia. Se demostró que la estabilidad conformacional de la proteína depende del pH, la temperatura y la fuerza iónica. 1H RMN. Se demostró la influencia de la temperatura y el pH en la exposición de los residuos de histidinas al solvente. Proteasa aspártica [4] Dicroísmo circular. Permitió demostrar que la estructura secundaria de la enzima recombinante en su estado nativo es de hojas b con un aporte significativo de contribuciones aromáticas, siendo bastante conservada con independencia del pH a baja fuerza iónica. Calorimetría diferencial de barrido. Demostró que la desnaturalización térmica inducida es irreversible y dependiente de la velocidad de barrido. La desnaturalización térmica a pH 3-7 está caracterizada por una única endoterma. A valores de pH superiores a 7,5 la desnaturalización se caracteriza por dos endotermas. Este comportamiento indica una compleja estructura de la enzima que fue explicada basándonos en los datos cristalográficos de la pepsina de Mucor pusillus con la que nuestra enzima tiene un alto porcentaje de homología. Fluorescencia. Demostró la estabilidad de la proteína en función del pH, obteniéndose a pH 5 la máxima estabilidad en correspondencia con los resultados de actividad. Invertasa [5, 6] Dicroísmo circular. Permitió demostrar que a pH 3-8 y baja fuerza iónica, la estructura secundaria de la enzima recombinante expresada en ambos hospederos es básicamente de hojas b, en correspondencia con los modelos teóricos propuestos. El efecto de la temperatura demostró que la glicosilación influye en la estabilidad conformacional de la enzima. Calorimetría diferencial de barrido. Demostró que la estabilidad
conformacional fue esencialmente similar para todas las condiciones estudiadas
aunque siempre significativamente superior para la invertasa expresada en Hansenula
polymorpha, sugiriendo que la presencia de los carbohidratos influye en
la estabilidad global. Las desnaturalizaciones térmicas fueron siempre Fluorescencia. Corroboró el comportamiento encontrado por calorimetría diferencial de barrido y dicroísmo circular. Además, evidenció que la irreversibilidad encontrada es producto de una cinética lenta de plegamiento a altas concentraciones. La combinación de diferentes métodos teóricos para la predicción de estructura tridimensional de proteínas y el método de dicroísmo circular, nos permitió proponer una estructura del tipo propela b, para dicha enzima. Este modelo tridimensional es compatible con el mecanismo catalítico propuesto para este tipo de enzimas y sugiere un nuevo aminoácido involucrado en la unión al sustrato para las enzimas del tipo b-fructofuranosidasa. Estreptoquinasa [7] Dicroísmo circular. Permitió demostrar que a pH 2-10, independientemente de la fuerza iónica, la estructura secundaria a+b no se ve afectada por la composición del tampón a temperatura ambiente. Con el aumento de la temperatura toda la estructura se destruye en conjunto. Calorimetría diferencial de barrido. Demostró que la estructura de múltiples dominios está fuertemente influenciada por el pH. La combinación del pH y la fuerza iónica demuestra efectos estabilizadores y desestabilizadores en dependencia de sus valores. Fluorescencia. Corroboró el comportamiento encontrado por calorimetría diferencial de barrido y dicroísmo circular. Conclusiones Este trabajo es la primera caracterización de los parámetros que influyen en la estabilidad conformacional de proteínas obtenidas por técnicas de ingeniería genética en el CIGB y que tienen una gran importancia comercial. Los parámetros calculados pueden ser utilizados dentro del error experimental como referencia durante el análisis de los lotes de proceso, donde cualquier desviación encontrada indicaría una variación en el plegamiento de la proteína y, por ende, en la calidad del producto obtenido. Complementariamente, la combinación de estas técnicas puede proporcionar una valiosa información acerca de la naturaleza del desplegamiento de una macromolécula y de las fuerzas que influyen en la estabilidad del estado nativo. Por ello, pueden ser ampliamente utilizadas para la rápida y efectiva evaluación de moléculas nuevas o modificadas producidas por técnicas de ingeniería genética con relevancia científico-comercial, ya sea para uso clínico o industrial, siendo una herramienta indispensable en el momento de elegir una estrategia para la obtención de una molécula muy estable térmicamente en óptimas condiciones biológicas. Además, pueden emplearse en el examen de la termodinámica de las interacciones entre macromoléculas y ligandos específicos en función de la temperatura, en estudios de oligomerización de proteínas o simplemente en la evaluación de la influencia de la estabilidad de una macromolécula en una formulación específica. Referencias
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