Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 18, Num. 2, 2001, pp. 99-100

Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp. 99-100

Code Number: BA01017

Introducción

De acuerdo con estimados recientes, existen aproximadamente 200 millones de personas infectadas de forma crónica por el virus de la hepatitis C (VHC), con frecuente aparición de formas severas como la cirrosis y el carcinoma hepatocelular. Estudios de prevalencia de anticuerpos anti-VHC en Cuba han mostrado un índice de 1,2% de la población total.

Hasta el momento no existe una vacuna contra el VHC disponible en el mercado y la terapia es efectiva en menos de 50% de los casos para las mejores alternativas de tratamiento con IFN-a combinado con otros antivirales.

Nuestro trabajo parte de la hipótesis de que es posible generar una respuesta inmune potente, diversa, modificable y activa frente a diferentes aislamientos del VHC mediante la inmunización con ADN plasmídico que codifica variantes de los antígenos de la región estructural del VHC, si se aprovechan las ventajas únicas de esta metodología.

Generación de los plasmidios para la inmunización con ADN

Primariamente, con el objetivo de evaluar de manera preliminar la inmunogenicidad de las proteínas de la región estructural del VHC, codificadas a partir de la secuencia nucleotídica de un aislamiento cubano, fueron obtenidas de manera individual diferentes variantes de estos antígenos por vía recombinante a partir de un sistema de expresión procariótico [1-3]. Estas variantes proteicas recombinantes de C, E1 y E2 resultaron muy inmunogénicas en ratones y conejos. Igualmente, estos antígenos resultaron inmunoreactivos contra sueros humanos anti-VHC, resultando funcionales en sistemas analíticos de tipo ELISA y en ensayos de linfoproliferación específicos [1-3].

De acuerdo con estos resultados, se generaron ocho variantes de plasmidios de inmunización con ADN utilizando secuencias que codifican los antígenos de la región estructural del VHC procedentes de un aislamiento cubano correspondiente al genotipo 1b [4]. El plasmidio pIDKCo contiene la secuencia codificante para los primeros 176 aminoácidos (aa) de la proteína de la cápsida. Los plasmidios pIDKE1S y pSIDKE1 contienen la secuencia codificante de E1 que comprenden los aa 192-363 de la poliproteína viral sola o fusionada al péptido señal de la eritropoyetina humana, respectivamente. Por su parte, pIDKE2S y pSIDKE2 contienen la secuencia codificante para la E2 que abarca los aa 384-716 de la poliproteína viral sola o fusionada al péptido señal de la eritropoyetina humana, respectivamente. El plasmidio pIDKE1 contiene la secuencia codificante para los antígenos de la cápsida y E1 comprendida entre los aa 1 y 363 de la poliproteína viral. El pSIDKE1E2 contiene la secuencia codificante de E1 y E2 comprendida entre los aa 192 y 716 de la poliproteína viral fusionada al péptido señal de la eritropoyetina humana. Finalmente, el plasmidio pIDKRET contiene la secuencia codificante para los antígenos de la región estructural del VHC. Los plasmidios de inmunización construidos contienen variantes individuales o combinadas de las proteínas de la región estructural del VHC. Estas proteínas contienen la mayoría de los epítopos inmunológicamente relevantes del VHC, algunos de los cuales son comunes a la mayoría de los aislamientos virales.

Caracterización de la respuesta inmune inducida en diferentes modelos animales

Todos los plasmidios de inmunización con ADN referidos anteriormente, indujeron una respuesta inmune específica detectable contra el VHC en ratones. Los títulos de anticuerpos contra las proteínas de la región estructural del VHC inducidos en ratones por la vacunación con ADN, oscilaron entre 1:50 y 1:15000 de acuerdo con la construcción genética y el antígeno en estudio (Tabla). Con el objetivo de comparar la respuesta humoral obtenida mediante la vacunación con ADN con la generada en individuos anti-VHC positivos, se investigaron los anticuerpos contra la cápsida viral. Estos anticuerpos son frecuentemente los primeros en aparecer durante la infección natural y aunque no parecen ser de naturaleza protectora, podrían estar relacionados con mecanismos de eliminación celular mediada por anticuerpos. Los anticuerpos específicos contra la proteína de la cápsida del VHC, producidos en animales inmunizados con el plasmidio pIDKCo, aparecieron 5 semanas después de la primera dosis en un esquema de 2 dosis en las semanas 0 y 3 (datos no mostrados). Estos anticuerpos mostraron similar especificidad inmunológica que los detectados en individuos infectados con VHC [5]. Estos datos indican que los antígenos producidos in vivo después de la inmunización con ADN podrían tener una conformación similar a la propia cuando forman parte del virión natural. Sin embargo, los niveles de anticuerpos inducidos por la administración de pIDKCo, pIDKE1 y pIDKRET fueron generalmente superiores a los encontrados en individuos anti-VHC positivos [5], lo que resalta la inmunogenicidad de las proteínas de la región estructural generadas por esta vía.

Tabla: Título de anticuerpos inducidos en ratones contra los antígenos de la región estructural del VHC después de la inmunización con diferentes plasmidios de expresión.

Plasmidio	Título de Ac contra Co	Título de Ac contra E1	Título de Ac contra E2
pAEC-K6	No, 0	No, 0	No, 0
pIDKCo	Sí, 8200	No, 0	No, 0
pIDKE1S	No, 0	Sí, 100	No, 0
pSIDKE1	No, 0	Sí, 55	No, 0
pIDKE2S	No, 0	No, 0	Sí, 57
pSIDKE2	No, 0	No, 0	Sí, 60
pIDKE1	Sí, 8400	Sí, 560	No, 0
pIDKRET	Sí, 15000	Sí, 6000	Sí, 8000
pSIDKE1E2	No, 0	Sí, 190	Sí, 135

Los resultados se muestran como el recíproco del título medio de anticuerpos contra los diferentes antígenos a la semana 27 de un esquema de inmunización de dos dosis en las semanas 0 y 3, inyectando por vía intramuscular 100 m g de cada uno de los plasmidios de expresión en solución fosfato salina. Sí, indica la presencia de la secuencia codificante para el antígeno analizado en el plasmidio de expresión; No, la ausencia.

Además, contrario a lo común para individuos infectados crónicamente con VHC, la inmunización con pIDKCo, pIDKE1 y pIDKRET posibilitó la generación de una respuesta linfoproliferativa específica de tipo CD4+ (Figura). La presencia de respuesta celular de tipo CD4+ se ha correlacionado frecuentemente con un curso benigno de la enfermedad o con su resolución.

Figura. Proliferación de linfocitos de bazo, provenientes de ratones inmunizados con pIDKCo, pIDKE1 y pIDKE2 frente
a proteínas de la región estructural obtenidas por la vía recombinante. pAEC-K6 es el plasmidio control negativo.
El índice de estimulación se determina de la siguiente forma: IE=cpm (exp) – cpm (basal). Las desviaciones estándar basadas en el cálculo de tres determinaciones diferentes se muestran por las barras de error en sentido positivo.

Como parte de la evaluación de la estrategia de trabajo, se evidenció por primera vez la influencia directa del régimen de vacunación sobre la respuesta inmune generada contra el VHC mediante la inmunización con ADN en ratones. Durante el estudio de los efectos de la inmunización con pIDKCo y pIDKRET en ratones, se demostró la superioridad de los esquemas de dos dosis con 50 mg de ADN plasmídico con tres semanas de intervalo entre ellas. Estos resultados tienen implicaciones importantes en el diseño de experimentos de inmunización en otros hospederos.

También se ha evidenciado la generación de niveles de anticuerpos superiores a 1:1000, contra los antígenos de la región estructural del VHC, en conejos y macacos irus inmunizados con pIDKRET 14 semanas después de la primera dosis. Estos resultados indican que, contrario a otras alternativas evaluadas internacionalmente, la inmunogenicidad evidenciada por la inmunización con el plasmidio pIDKRET no decae en animales robustos.

Conclusiones

Este trabajo posee un alto nivel de novedad científica dada fundamentalmente por los materiales biológicos y los procedimientos descritos. El plasmidio pIDKRET incluye en su composición la secuencia nucleotídica proveniente del genoma de un aislamiento cubano del VHC, el cual posee al menos 8% de diferencia, a este nivel, con respecto a los otros reportados. Además, el fragmento aminoacídico comprendido en la versión proteica resultante no había sido explorado previamente con este enfoque vacunal. Esta región contiene la mayoría de los epítopos inmunológicamente relevantes del VHC y su presencia simultánea parece tener un efecto sinérgico, no demostrado con anterioridad, de potenciación y diversificación de la respuesta inmune específica generada después de la administración del plasmidio.

Actualmente se continúan estos estudios y se profundiza en el análisis de la respuesta inmune. Se investiga también la influencia de las estrategias de vacunación y formulación con los plasmidios pIDKCo y pIDKRET en conejos y carneros para el posterior tránsito a chimpancés.

Referencias

1. Dueñas-Carrera S, Morales J, Acosta-Rivero N, Lorenzo LJ, García C, Ramos T, et al. Variable level expression of hepatitis C virus core protein in a prokaryotic system. Analysis of the humoral response in rabbit. Biotecnología Aplicada 1999;16(4):226-31.

2. Lorenzo LJ, García O, Acosta-Rivero N, Dueñas-Carrera S, Martínez G, Álvarez-Obregon J, et al. Expression and immunological evaluation of the Escherichia coli-derived hepatitis C virus envelope E1 protein. Biotechnol Appl Biochem 2000;32(2):137–43.

3. Martínez G, Viña A, Borges M, Martínez E, Morales J. Humoral immune response against hepatitis C virus envelope E2 variant expressed in Escherichia coli. Biotecnología Aplicada 2000;17:231–4.

4. Morales J, Viña A, García C, Acosta-Rivero N, Dueñas-Carrera S, García O, Guerra I, inventors; CIGB, assignee. Sequences derived from the genome of the hepatitis C virus, and use thereof. WO 98/25960.

5. Dueñas-Carrera S, Álvarez-Lajonchere L, Álvarez-Obregón JC, Herrera AM, Lorenzo LJ, Pichardo D, et al. A truncated variant of the hepatitis C virus core induces a slow but potent immune response in mice following DNA immunization. Vaccine 2000;19(7):992–7.

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