Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 18, Num. 2, 2001, pp. 101-102

Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp. 101-102

Code Number: BA01018

Introducción

La idea de expresar el fragmento scFv en plantas transgénicas se deriva de información internacional creciente que sugiere que, para un conjunto de anticuerpos terapéuticos y sus fragmentos, las plantas transgénicas pueden constituir una variante productiva más económica que otros sistemas, y donde se pueden alcanzar volúmenes muy grandes del producto final.

El presente trabajo está encaminado a evaluar bajo qué condiciones y hacia cuáles compartimentos celulares puede realizarse la expresión del scFv antiHBsAg.

Clonación del gen antiHBsAg y transformación de plantas de tabaco

A partir de la construcción bacteriana [1] se aisló el gen que codifica para el fragmento scFv antiHBsAg, más una secuencia N-terminal de 6 histidinas, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se emplearon para ello oligonucleótidos específicos que además confirieron al gen sitios de restricción adecuados para la clonación en vectores de plantas que contenían la región promotora 35S de expresión constitutiva, provenientes del virus de mosaico de la coliflor, el terminador Nos de la nopalina-sintetasa y diferentes señales de localización (el prepéptido y el propéptido de la esporamina del boniato, y una secuencia KDEL C-terminal para la retención en retículo endoplasmático). Se fabricaron 4 construcciones genéticas con el fin de evaluar el comportamiento de la expresión del scFv en diferentes compartimentos: retículo endoplasmático, vacuola, fluido apoplástico y citosol. Todas las construcciones se sometieron a un análisis de secuencia con lo cual se verificaron los empalmes realizados y la ausencia de mutaciones en el gen clonado. Los cuatro "cassettes" se subclonaron en un vector de expresión para la transformación de plantas mediante el método de Agrobacterium tumefaciens.

Se transformaron plantas de tabaco var. Petit Havana SR1 y se obtuvieron plantas F0 resistentes a kanamicina. La presencia del transgén se chequeó por PCR. Plantas F1 representativas de cada una de las cuatro construcciones genéticas, se ensayaron mediante un ELISA cuantitativo específico, basado en un recubrimiento con HBsAg recombinante, un anticuerpo policlonal de conejo anti-Fab específico al anticuerpo original murino anti-HBsAg, y un anticuerpo policlonal anti-IgG de conejo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina para revelar la reacción. El ELISA se calibró mediante una curva estándar empleando scFv bacteriano purificado por cromatografía de afinidad. Las muestras se obtuvieron a partir de hojas verdes frescas molidas y tratadas con un tampón adecuado.

Detección de la expresión de la proteína en plantas de tabaco

El ELISA indicó que la mayor expresión de scFv activo se producía en las plantas transformadas con la construcción para la acumulación en el retículo endoplasmático (alrededor de 0,3% del total de proteínas soluble extraídas [TPS]). Las plantas correspondientes a las construcciones para vacuola y fluido apoplástico exhibieron por cientos de expresión menores (0,01%-0,03% TPS). No se detectó expresión del fragmento activo en el citosol.

Líneas de plantas representativas de cada una de las cuatro construcciones (RE-52 para retículo endoplasmático, AF-12 para fluido apoplástico, V-20 para vacuola, y C-17 para citosol) se emplearon para un experimento de Western blot que detecta scFv total (activo y no activo), al revelarse con el anticuerpo anti-Fab mencionado antes. Este experimento repitió el comportamiento detectado en el ELISA cuantitativo.

Se purificó entonces ácido ribonucleico (ARN) de estas cuatro líneas y se desarrolló una reacción de transcripción inversa (RT)-PCR con oligonucleótidos específicos para el gen del scFv. En este experimento demostramos que en las cuatro líneas se produce ARN mensajero específico. Estos resultados sugieren que la no detección de expresión de proteína scFv en el citosol puede deberse a problemas en la traducción o postraduccionales. En el ambiente del citosol, sin proteínas chaperonas ni un ambiente proclive a la formación de los enlaces disulfuros, la proteína naciente es probablemente degradada rápidamente por proteasas citosólicas.

La localización del fragmento de anticuerpo se chequeó primero mediante un experimento donde se infiltraron las hojas verdes frescas de las construcciones RE, AF y V, y el fluido extracelular resultante se concentró y estudió por Western blot. Se demostró que sólo la construcción AF-12 producía una banda detectable de la talla esperada para el scFv. Esto sugiere por un lado que el segmento KDEL añadido para la retención en retículo endoplasmático funciona. Este segmento pudiera también ser responsable del mayor nivel de expresión encontrado para esta construcción, ya que se reporta que la misma protege de las proteasas citosólicas el extremo C-terminal de la proteína recién traducida, antes de su translocación final al retículo.

Se realizó también un estudio de las células vegetales de cada construcción mediante inmunomicroscopía electrónica, empleando el anticuerpo anti-Fab marcado con oro coloidal. Se demostró marcaje en vacuolas sólo en la construcción V-20, marcaje en el apoplasto en la construcción AF-12, comprobándose que las secuencias señales empleadas en este caso (pre y propéptido de la esporamina) habían sido efectivas para la localización dirigida del fragmento de anticuerpo. En estos experimentos tampoco se detectó scFv en las muestras de la construcción citosólica. En la construcción RE-52 se obtuvieron evidencias iniciales de que en algunas células el scFv podía aparecer en núcleo y cloroplasto, resultado que debe ser profundizado debido a que ha sido reportado sólo en un estudio anterior de otros autores.

Purificación de la proteína

Finalmente, se procedió a la purificación del scFv a partir de material molido de hojas verdes frescas de la línea RE-52, y fluido de infiltración de hojas verdes frescas de la línea AF-12. Para ello se empleó la cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC), que había sido ya empleada con éxito en el CIGB para la purificación del scFv obtenido en E. coli, aprovechando el segmento N-terminal de 6 histidinas que posee la proteína.

Luego de un solo paso de cromatografía se obtuvieron altos porcentajes de pureza (95% y 94% para ER-52 y AF-12, respectivamente), y recobrados específicos (fragmento aplicado versus fragmento eluído, corregido para pureza final) de 70% y 60% para ER-52 y AF-12, respectivamente. Teniendo en cuenta la cantidad de proteína aplicada en la purificación, y con el dato de la cantidad de material verde que debe ser procesado en cada caso (molida e infiltración), se calculó que es posible producir entre 20-25 µg/g de hoja para ER-52, y entre 7-8 µg/g de hoja para AF-12. Al scFv purificado por IMAC se le determinó la actividad específica mediante el ELISA cuantitativo. El valor obtenido para ER-52 fue de 82,5%, mientras que para AF-12 fue de 69%.

Ajustando las cantidades obtenidas a escala de laboratorio y sin someter el proceso de extracción/purificación a optimización, la proyección inicial de scFv puro y activo por hectárea llega a alrededor de 1 kg total, dependiente del método de cultivo empleado.

Se estableció también una suspensión celular estable en cultivo a partir de células de callos de la línea transgénica AF-12. Se demostró que el scFv se obtiene activo tanto en el sobrenadante de cultivo (donde es estable por más de 8\98 h), como a partir del extracto celular. Estos materiales pudieron purificarse también por IMAC. La proteína purificada se secuenció en su extremo N-terminal y se comprobó que las secuencias empleadas para la localización de la proteína en este compartimiento extracelular se procesan correctamente.

También se evaluaron semillas provenientes de las plantas transgénicas derivadas de las líneas AF-12 y V-20. Se demostró que al menos hasta la tercera generación se mantiene en las plantas transformadas el carácter introducido. Se comprobó además que de estas semillas es posible extraer el scFv activo (medido por ELISA) y en cantidades similares hasta 18 meses después de colectadas y almacenadas a temperatura ambiente. A pesar de que no se usó un promotor específico para semillas, el por ciento de expresión de proteína respecto a las proteínas solubles purificadas fue de alrededor de 0,2%.

Conclusiones

Nuestro trabajo demuestra que este scFv particular se expresa exitosamente en plantas transgénicas de tabaco, que mantienen una estabilidad aceptable del carácter introducido, y de las cuales pueden obtenerse grandes volúmenes del fragmento activo puro mediante procedimientos relativamente sencillos. Debido a estas características, así como a las ventajas de esta tecnología relativas a la ausencia de virus infectivos para el hombre, o ADN y LPS bacterianos contaminantes, se ha comenzado un estudio de escalado que produzca una optimización del proceso a la par de un estudio detallado de costos, en comparación con la fermentación bacteriana para obtener cantidades del orden de kg del scFv/año.

Estos resultados han abierto el camino para la introducción de esta nueva tecnología a la producción de otros anticuerpos y fragmentos. Ya se han comenzado los trabajos conjuntos con el Centro de Inmunología Molecular de La Habana, Cuba para la expresión de dos anticuerpos terapéuticos de ese centro en plantas transgénicas de tabaco, como forma de escalado que permita superar las limitaciones en costo y capacidad de la producción a partir de cultivo de hibridomas.

Referencias

1. Ayala M, Fernández-de-Cossío ME, Canaán-Haden L, Balint RF, Larrick JW, Gavilondo JV. Variable Region Sequence Modulates Periplasmic Export of a Single Chain Fv Antibody Fragment in E. coli. BioTechniques 1995;18: 832–42.