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Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp 105-106
Miriam Ojeda Ojeda, Celia Fernández-Ortega, Manuel de J Araña Rosaínz
Code Number: BA01020 Introducción Poco se conoce sobre los mecanismos de acción del extracto dializable de leucocitos (EDL) o factor de transferencia, sin embargo, numerosos estudios han establecido inequívocamente la eficacia del EDL en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades de orígen parasitario, bacteriano, viral y otras [1, 2]. Actualmente se desconocen los mecanismos moleculares precisos que median la actividad biológica del EDL sobre la infección por el VIH. Este trabajo presenta datos novedosos que indican un potente efecto supresor del EDL sobre la expresión génica del VIH. Efecto inhibitorio de la preparación de EDL sobre la actividad del factor transcripcional NF-kB Las proteínas pertenecientes a la familia NF-kB están implicadas en la regulación de disímiles procesos celulares tales como la respuesta inmune e inflamatoria, proliferación celular y apoptosis. Ha sido demostrado que los elementos kB son necesarios para la expresión génica inducible del VIH en células T activadas y monocitos maduros. La permeabilidad celular a la infección viral está estrechamente relacionada con la abundancia relativa de factores reguladores de la transcripción que interactúan con éstos y otras secuencias específicas dentro de la secuencia LTR (del inglés long terminal repeat) del VIH. La mutación de nucleótidos determinantes en las secuencias enhancer involucradas en la unión del factor inducido NF-kB, convierte el elemento LTR del VIH en no respondedor a aquellos estímulos capaces de inducir la translocación nuclear de este factor transcripcional [3]. En este trabajo se estudió el efecto del EDL sobre la actividad de NF-kB en células CD4+ mediante ensayos de retardación en gel. El factor NF-kB es constitutivamente activo en la línea celular MT-4. Las células MT-4 se expusieron a diferentes dosis de EDL (0; 1,25 y 2,5 U/mL) durante 7 días de cultivo y se prepararon los extractos nucleares transcurridas 0 h, 3 h, 3 días y 7 días de tratamiento con la preparación de EDL. Los resultados evidencian una disminución considerable de la actividad de unión de NF-kB en las células MT-4 tratadas con EDL en relación con las células no tratadas. La inhibición de la actividad de NF-kB se observó en tiempos tan tempranos como 3 h de cultivo en presencia de EDL. Períodos de incubación más prolongados potencian el efecto inhibitorio en las condiciones experimentales establecidas. Se observó una reducción de las cantidades del complejo proteína-ADN en función del incremento de las dosis de EDL utilizadas. De manera significativa, la preparación de EDL a 2,5 U/mL inhibe completamente la activación de NF-kB luego de 7 días de tratamiento del cultivo de MT-4 (Figura). Efecto inhibitorio de la preparación de EDL sobre la actividad del factor transcripcional Sp1 Se ha reportado que deleciones en ambos elementos NF-kB del LTR del VIH pueden afectar seriamente la capacidad replicativa del VIH en diferentes tipos celulares. Un requisito fundamental para la replicación del virus carente de secuencias de unión para NF-kB, es la presencia de los tres elementos Sp1. Por otra parte, la eliminación simultánea de todos los sitios de unión tanto para NF-kB como Sp1 resulta en un provirus incapaz de replicarse en células CD4+ humanas [4]. Teniendo en cuenta estos elementos, nosotros estudiamos el efecto del producto EDL sobre la actividad Sp1 en las células MT-4. Los resultados muestran una modificación de la actividad de unión de Sp1 en las células linfoblastoides tratadas con EDL. Como se puede apreciar, el efecto de inhibición por EDL se incrementa en función de la dosis utilizada así como en tiempos prolongados de cultivo. Luego de tres días de cultivo, se aprecia el complejo de unión Sp1-ADN en las células no tratadas; sin embargo, el tratamiento del cultivo celular con dosis crecientes de EDL está directamente relacionado con la disminución de la actividad de unión Sp1 en los extractos nucleares de las células tratadas con EDL. Transcurridos 7 días de cultivo en presencia de EDL, se recupera la actividad constitutiva de Sp1 en presencia de dosis menores de EDL, pero no en aquellas células tratadas con elevadas dosis de la preparación de EDL. Para la identificación de proteínas Sp1 en los complejos proteína-ADN, se incubaron previamente los extractos nucleares de MT-4 con oligonucleótidos específicos para Sp1 (Figura). Figura 1. Capacidad de la preparación de EDL de inhibir la actividad de unión a secuencias específicas de ADN de los factores transcripcionales NF-kB y Sp1 en la línea celular MT-4. Las células se cultivaron en presencia o ausencia de diferentes dosis de EDL (0, 1,25 y 2,5 U/mL) durante 7 días. Los extractos nucleares de cada punto experimental (0 h, 3 h, 3 y 7 días) se incubaron con el oligonucleótido específico marcado con (g-P32) ATP. Los complejos de unión proteína-ADN se separaron en un gel de poliacrilamida al 6%. La reducción de la formación del complejo NF-kB-ADN es de manera dosis dependiente y se incrementa en función del tiempo del cultivo celular en presencia de EDL. Es de destacar que el producto EDL a una dosis de 2,5 U/mL inhibe completamente la activación del factor transcripcional NF-kB luego de 7 días de cultivo de las células MT-4. De igual forma, se observa un efecto inhibitorio sobre la formación del complejo Sp1 a los 7 días de cultivo celular en presencia de EDL. La preparación de EDL no afecta la actividad de unión de AP-1 en células MT-4 Para demostrar la especificidad del efecto supresor de EDL sobre los factores transcripcionales esenciales para la expresión génica del VIH, se realizaron experimentos similares para determinar la actividad de unión del factor AP-1 en células MT-4 tratadas con EDL. Los extractos nucleares de los diferentes puntos experimentales analizados en los ensayos de retardación en gel, no mostraron afectación alguna de la actividad transcripcional AP-1 en presencia de las diferentes dosis de EDL empleadas. La preparación de EDL no afecta la transcripción de los genes p65NF-kB e IkBa en células MT-4 La activación del sistema NF-kB se controla a distintos niveles de regulación. Diferentes estudios indican la necesidad de un nivel basal de la proteína inhibitoria IkBa capaz de inhibir completamente al factor NF-kB, y además demuestran niveles elevados de transcriptos de IkBa en células que expresan la subunidad transactivadora RelA(p65) de NF-kB [5]. Mediante técnicas de RT-PCR se analizó la expresión de los genes p65 NF-kB e IkBa en células MT-4 cultivadas en presencia de EDL. Se observaron cantidades similares del producto amplificado de los genes p65 NF-kB e IkBa en células MT-4 tanto tratadas como no tratadas con EDL. Los resultados experimentales indican que el efecto inhibitorio del EDL sobre NF-kB en células MT-4, no está mediado por una regulación del balance RelA-IkBa nivel transcripcional. Conclusiones Estos datos contribuyen a esclarecer nuestras observaciones previas [6, 7]. En presencia de concentraciones de VIH elevadas, el EDL provocó una reducción superior a 70% de la cantidad de antígeno p24 presente en los sobrenadantes de cultivo de MT-4. Por otra parte, la disminución de la actividad NF-kB en células MT-4 luego de períodos cortos de tratamiento puede ser funcionalmente relevante para la inhibición de la producción de TNFa inducida por lipopolisacários (LPS) bacterianos, observada en condiciones de pre-tratamiento o incubación simultánea con EDL, tanto en leucocitos de sangre periférica como en cultivos de sangre total de individuos sanos. Estos resultados contribuyen a la caracterización y definición de los mecanismos moleculares que median las disímiles actividades biológicas del producto EDL. El primer reporte de la capacidad de un producto natural de origen humano como el EDL [8], de inhibir la actividad del factor transcripcional NF-kB, puede tener grandes implicaciones para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas utilizando nuestra preparación de EDL en enfermedades como infecciones severas, shock séptico y en la infección por VIH. Referencias
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