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Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp. 107-108
Dina Tleugabulova,1 Viviana Falcón Cama,2 Eduardo Pentón Arias,2 Julio Aguilar Rubido,2 Eduardo Martínez Díaz,2 Minerva Sewer Mensiés1
1Biocen. Bejucal, La Habana, Cuba.
Code Number: BA01021 Introducción Los estudios controlados y la experiencia internacional de más de 10 años de aplicación masiva, han demostrado que la vacuna basada en el AgsHB es efectiva y segura para la prevención de la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) [1]. Algunos intentos realizados para extender el uso de la vacuna a la terapéutica de la enfermedad han producido resultados favorables, pero aún por debajo de las expectativas [2-4]. Por otra parte, un 5-10% de los vacunados, la inmunidad no se logra debido a factores genéticos [5-7] o de otro tipo [8-10]. El presente estudio tiene como propósito la caracterización de variantes antigénicas capaces de lograr una respuesta más rápida y eficiente, reclutar efectores celulares del sistema inmune como los linfocitos T citotóxicos, intensificar la inmunogenicidad del AgsHB y ampliar el rango de sus aplicaciones hacia el terreno terapéutico. Caracterización físico-química El AgsHB recombinante producido en levadura está compuesto por unas 100-130 subunidades de la proteína S (monómero del AgsHB), las cuales se ensamblan de forma espontánea con lípidos de la pared celular de la levadura para dar lugar a partículas inmunogénicas de 22 nm de diámetro como promedio [1]. En la actualidad, la estructura tridimensional detallada del AgsHB no es conocida, la hidrofobicidad, resistencia a la hidrólisis enzimática y el alto contenido de lípidos dificultan la aplicación de estrategias convencionales para la caracterización físico-química del AgsHB [11]. Debido a las dificultades señaladas, se desarrolló una vía alternativa para la caracterización del AgsHB que consistió en el fraccionamiento de la preparación del antígeno purificado en una columna preparativa de SEC y el análisis de las fracciones por una batería de técnicas físico-químicas e inmunoquímicas, tales como SEC en modo analítico, microscopía electrónica, electroforesis, inmunoensayo e inmunoafinidad (análisis multidimensional). El conjunto de datos provenientes de estos diferentes métodos analíticos fue interpretado de forma integral [12, 13], mediante un enfoque novedoso que puede ser generalizado al análisis de otras subpartículas virales. La aplicación de este enfoque multidimensional permitió demostrar la existencia de una fracción minoritaria del antígeno con modificaciones en el enlace por puentes disulfuro, que aunque no afectan el ensamblaje y la antigenicidad del AgsHB, sí contribuyen a la heterogeneidad molecular y, en consecuencia, al ensanchamiento del pico correspondiente al AgsHB en el perfil cromatográfico en SEC [14]. Se desarrolló un método SEC en condiciones desnaturalizantes, el cual se convirtió en la principal herramienta de trabajo para la optimización de las condiciones de reducción del AgsHB [15], la detección de productos de degradación [13], el análisis del antígeno oxidado in vitro [16] y el análisis del antígeno desadsorbido del gel de hidróxido de aluminio [17]. La combinación del análisis cromatográfico y electroforético del antígeno desadsorbido del gel de hidróxido de aluminio con la visualización directa del antígeno adsorbido por microscopía electrónica de transmisión e inmunomicroscopía [17], permitió probar experimentalmente una hipótesis previamente sustentada por otros autores sobre una posible desnaturalización del antígeno después de su adsorción sobre el gel de hidróxido de aluminio [18]. El resultado de mayor relevancia científica y práctica fue la identificación de estructuras supramoleculares compuestas por un número variable de partículas del AgsHB aparentemente intactas en el interior de la célula de la levadura, y la caracterización físico-química de estos agregados [19]. Se demostró que más de 40% del AgsHB en el extracto crudo de la levadura P. pastoris transformada para la producción de este antígeno se encuentra en forma agregada. Agregados similares fueron anteriormente aislados del extracto crudo por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa [20]. Caracterización inmunobiológica La demostración experimental de que los agregados del AgsHB son capaces de inducir en ratones una respuesta inmune superior a la del antígeno nativo, constituye un antecedente válido para explorar la posibilidad de su uso en el desarrollo de una nueva vacuna para las formas crónicas de la hepatitis B. Esta expectativa se basa en que la variante antigénica agregada posee una capacidad de promoción de hipersensibilidad retardada (DTH) en el ratón significativamente superior a la del antígeno no agregado. Como se ha reportado el reclutamiento y la inducción de actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL) por las proteínas agregadas [21], y se conoce también que esta actividad está vinculada a la eliminación de los hepatocitos infectados por el VHB [22], estos hechos pueden explicar, total o parcialmente, la mayor inmunogenicidad de la vacuna Heberbiovac HB, demostrada en numerosos ensayos clínicos dentro y fuera del país [1], debido a su contenido de antígeno agregado. Por último, como se dispone de evidencias de que existe una respuesta inmune humoral contra el AgsHB agregado significativamente superior que la del antígeno no agregado, se puede suponer que el antígeno agregado podría comportarse también como un mejor inmunógeno en el humano y proporcionar una vacuna de mayor calidad. Figura. Estudio comparativo de la respuesta de anticuerpos anti-AgsHB y de hipersensibilidad retardada -DTH- en ratones, obtenida por inmunización con las formas nativa y agregada del AgsHB. En el gráfico precedente se puede apreciar que la respuesta inmune humoral generada por el antígeno agregado fue significativamente superior a la generada por el antígeno nativo, tanto adsorbidos en alúmina por vía intramuscular (grupos D y E) como inoculados por vía intranasal en PBS (grupos A y C) (p < 0,05). En el estudio de agregación del AgsHB inducido in vitro por el estrés oxidativo [16], se plantea por primera vez una posible oxidación del AgsHB por radicales libres en las células vivas. Esta posibilidad no se había considerado antes a pesar de la evidencia clínica documentada sobre el estrés oxidativo y una elevada peroxidación lipídica en pacientes con hepatitis B crónica [23]. La oxidación del AgsHB viral pudiera ser la causa principal de la formación de agregados plasmáticos in vivo, los cuales pudieran desencadenar mecanismos patogénicos en el organismo no descritos hasta ahora. Esta última hipótesis está en vías de desarrollo actualmente. Aunque en su estado actual de desarrollo este trabajo no reivindica aportes económicos directos, los resultados del presente estudio contribuyeron a la decisión de no utilizar la microscopía electrónica para el control rutinario del AgsHB y se optimizó la recolección del AgsHB durante la purificación preparativa por SEC, lo que condujo a la eliminación de rechazos del producto por concepto de pureza [24]. Estas mejoras contribuyen de modo indirecto a una reducción del costo de la producción. Referencias
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