Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 18, Num. 2, 2001, pp. 112

Biotecnología Aplicada, Vol. 18, No. 2, April 2001, pp. 112

Code Number: BA01023

Introducción

Las técnicas más modernas de identificación de proteínas en muestras biológicas complejas, utilizan la separación por electroforesis seguida de la digestión de las proteínas de interés con proteasas específicas. La mezcla de péptidos obtenida se analiza a continuación por espectrometría de masas. Generalmente las digestiones de proteínas en geles verifican una parte de la secuencia (20%-40% son valores de cobertura de secuencia habituales obtenidos por este método). Esto es suficiente para la identificación de proteínas mediante búsqueda en bancos de datos. Sin embargo, cuando el propósito es identificar modificaciones postraduccionales o identificar mutaciones o variantes de una proteína, es necesario obtener coberturas de secuencias mucho mayores, que se acerquen lo más posible a la secuencia total de la proteína. Este es un problema técnicamente complejo. Para poder lograrlo se hace necesario la optimización de un conjunto de factores, cada uno de los cuales contribuye desde su parte al éxito o al fracaso de la estrategia global. El presente trabajo a) propuso una solución a este problema mediante el aumento del porcentaje de cobertura de secuencia en geles de SDS a valores muy altos, equivalentes a los logrados en digestiones en solución, b) extendió las digestiones a geles de focalización isoeléctrica (IEF) en anfolinas portadoras (CA) y en inmobilinas (IPG), y c) permitió acoplar de una manera novedosa las electroforesis desnaturalizante y de IEF como vía de resolución de las mezclas de proteínas que comigran en una misma talla molecular en geles de SDS.

Métodos desarrollados

1. Un procedimiento de digestión de proteínas en geles de SDS seguido del recobrado de péptidos, que ha permitido obtener coberturas de secuencias muy altas (por ejemplo, a partir de 0,5 mg de estreptoquinasa recombinante, 98,8% de cobertura; para la eritropoyetina, 91% de cobertura). Estos resultados son comparables a los logrados en digestiones en solución con cantidades de material mucho mayores.
2. Un nuevo procedimiento de digestión para las proteínas en geles de IEF-CA e IEF-IPG. Fue posible encontrar condiciones para eliminar las anfolinas portadoras que al mismo tiempo permitan una eficiente digestión de las proteínas dentro de las bandas de gel. La técnica permite analizar por espectrometría de masas las digestiones obtenidas en geles de focalización isoeléctrica.
3. Un nuevo procedimiento para el reanálisis de proteínas contenidas en bandas de geles de SDS por electroforesis en geles de IEF e IPG.

Estos resultados se integran en un método que permite la identificación de proteínas por espectrometría de masas a partir de separaciones en geles de focalización isoeléctrica, utilizando esta técnica como una segunda dimensión de separación tras la resolución inicial de geles de SDS.

Conclusiones

La combinación de estos elementos tecnológicos ha permitido diseñar un protocolo de digestión de proteínas de alta eficiencia y un procedimiento para el reanálisis de proteínas separadas en geles de SDS mediante un segundo principio, en este caso la focalización isoeléctrica. Estos procedimientos se han aplicado con éxito a la identificación de interleucina 6 [1], estreptoquinasa y eritropoyetina [2] y de las modificaciones postraduccionales (sitios de fosforilación) de la oncoproteína 18 (stathmina) [3]. Actualmente la tecnología desarrollada para el reanálisis de proteínas separadas en geles de SDS por focalización isoeléctrica está siendo utilizada en la identificación de proteínas naturales.

Referencias

1. Castellanos-Serra L, Proenza W, Huerta V, Moritz RL, Simpson RJ. Proteome analysis of polyacrylamide gel-separated proteins visualized by reversible negative staining using imidazole-zinc salts. Electrophoresis 1999;20:732–7.

2. Castellanos-Serra L, Hardy E, Proenza W, Huerta V, González LJ, Le Caer JP, et al. Reversible negative staining of protein on electrophoresis gels by imidazole-zinc salts: micropeparative applications to proteome analysis by mass spectrometry. En: RM Kamp, D Kyriakidis, T Choli-Papadopoulou (Eds.) Proteome and protein analysis. Springer, 1999:29–52.

3. Castellanos-Serra L, Vallin A, Proenza W, Le Caer JP, Rossier J. An optimized procedure for protein detection on CA-IEF and IPG gels. Aplication to the identification of IEF-separated isoforms by in-gel proteolysis and mass spectrometry analysis. Electrophoresis 2001;22 (In press).