Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 1, 1995, pp. 1-8

TRABAJO DE REVISION/REVIEW ARTICLE

APOPTOSIS: CARACTERISTICAS GENERALES Y SUS IMPLICACIONES EN PROCESOS FISIOPATOLOGICOS

Lourdes Rodriguez ^1 y Jorge Alberto Reyes- Esparza ^2

^1 Instituto Nacional de la Nutricion "Salvador Zubiran", Departamento de Gastroenterologia "Vasco de Quiroga" 15 Tlalpan, 14000 Mexico D.F. ^2 Instituto Nacional de Cancerologia, Division de Investigacion Basica, Mexico D.F.

Code Number: BA95001
Size of Files:
   Text: 42K
   No associated graphics files

Recibido en febrero de 1995. Aprobado em marzo de 1995.

Key words: Apoptosis, programmed cell death.

SUMMARY

Apoptosis is a mode of cellular death with characteristic structural features. The set of cellular events that results is regulated by gene expression. Since this mode of cellular death plays animportant role in many physiological and pathological processes, its control and regulation maylead to new therapeutic approaches for treatment of a great variety of diseases.

RESUMEN

La apoptosis es un modo de muerte celular con cambios estructurales caracteristicos. El conjunto de eventos celulares que resultan son regulados por la expresion de genes. Puesto que esta forma de muerte celular desempena un papel importante en muchos procesos fisiologicos y patologicos, su regulacion y control pueden conducir a nuevas estrategias terapeuticas para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades.

INTRODUCCION

En los anos recientes se ha reconocido ampliamente que la perdida espontanea de celulas es un parametro importante en la homeostasis de tejidos normales (proliferacion celular y recambio versus muerte celular). Asimismo, se ha reconocido que las celulas deben perderse continuamente en muchos tejidos normales para equilibrar la division celular; pues de lo contrario cuando este balance se altera el resultado final puede ser una expansion tumoral de celulas.

El descubrimiento de un modo diferente de muerte celular (muerte celular programada) cuyas caracteristicas ultraestructurales son consistentes con un fenomeno controlado y activo, apoyan la hipotesis de que la muerte celular desempena un papel importante en la regulacion del numero de celulas en una variedad de tejidos, bajo condiciones fisiologicas y patologicas (Wyllie et al., 1980, Walker et al., 1988; Cohen 1991; Saunder, 1966).

Los terminos apoptosis, muerte celular programada, muerte celular activa o suicidio celular, son usados para definir un modo particular de muerte celular, caracterizado por un modelo especifico de cambios en nucleo y citoplasma (Kerr et al., 1972). De estos, el termino apoptosis es el mas ampliamente usado, y fue introducido por Kerr en 1972. Sus caracteristicas morfologicas sugieren que es un fenomeno activo y programado, y ha sido mostrado que este puede ser asociado o inhibido por una variedad de estimulos ambientales, ambos fisiologicos y patologicos. La amplia ocurrencia de apoptosis ha despertado el interes en un gran numero de investigadores por definir los mecanismos celulares reguladores y procesos bioquimicos involucrados. El conocimiento de estos mecanismos podra conducir a nuevos enfoques terapeuticos para el tratamiento de enfermedades como el cancer y el SIDA, entre otras. A continuacion describiremos brevemente algunos de los avances mas recientes con relacion a este fenomeno, su significado y su repercusion en algunos procesos involucrados.

Caracteristicas morfologicas de la apoptosis

La apoptosis afecta especificamente a celulas individuales, por lo tanto es facil su identificacion mediante microscopio de luz. Los cambios morfologicos observados durante la apoptosis han sido extensamente estudiados y revisados por varios laboratorios (Alle, 1989; Collins, 1991). Los estudios realizados utilizando microscopio electronico han mostrado que existe cierta secuencia de eventos que hacen de la apoptosis una forma de muerte celular con caracteristicas morfologicas distintivas. El evento morfologico inicial no ha sido identificado, pues cuando se reconoce que la celula esta sufriendo apoptosis ya presenta algunos de los cambios morfologicos tipicos.

Las celulas afectadas reducen su volumen, pierden contacto con las celulas vecinas y pierden elementos de superficie especializados como las microvellosidades y uniones celula-celula. Varios estudios han mostrado que estos cambios ocurren rapidamente. Existe una notable condensacion del nucleo y del citoplasma, probablemente por salida del liquido celular. Hay separacion de pequenos fragmentos celulares que permanecen unidos o cercanos a la superficie celular. Estos remanentes celulares son los llamados cuerpos apoptoticos, que se caracterizan porque estan bien conservados y contienen organelos, los cuales pueden estar condensados pero estan aparentemente intactos, tanto quimicamente como estructuralmente. Incluso se observan vacuolas citoplasmicas y masas densas de material nuclear en algunos cuerpos. Es importante senalar que estos cuerpos nunca muestran evidencia ultraestructural de degeneracion y es probable que en esa etapa ellos sean capaces de presentar actividad metabolica.

El reticulo endoplasmico se dilata y aparece una serie de cavidades semejantes a crateres, de tal manera que las cisternas dilatadas se fusionan con la superficie celular. Inicialmente y a diferencia de la necrosis, las mitocondrias son normales en estructura. Los cambios estructurales internos mas sobresalientes ocurren en el nucleo (Arends et al., 1990). La cromatina se condensa en capsulas granulares densas bajo la membrana nuclear. Adyacente a eso, los poros nucleares desaparecen. El nucleolo se disocia y da origen a particulas osmiofilicas que estan estrechamente asociadas a la periferia de la cromatina condensada. Todos esos cambios nucleares llevan a la ruptura de la cromatina, de tal manera que el ADN de las celulas apoptoticas se reducen a una serie de fragmentos del tamano de los nucleosomas (180-200 pares de bases) (Wyllie, 1984).

Las celulas en apoptosis no inducen una reaccion inflamatoria, incluso cuando se presenta en un gran numero de celulas. Sin embargo, ellas son el blanco de fagocitosis inmediata, ya sea por macrofagos presentes o por otras celulas adyacentes. Los cuerpos apoptoticos ingeridos por otras celulas, sufren un proceso dentro de los fagosomas,que es estructuralmente similar al que ocurre en la autolisis in vitro de celulas integras. Las enzimas lisosomales desempenan un papel importante en la degradacion posterior de los cuerpos fagocitados. De esta manera son rapidamente reducidos a cuerpos lisosomales.

Es dificil precisar el tiempo que toma la secuencia de eventos descritos antes, pues la apoptosis sucede continuamente en tejidos fetales, tejidos del adulto y en neoplasmas en crecimiento; incluso cuando aumenta por varios estimulos, el proceso se inicia en celulas individuales de un mismo organo o tejido en tiempos diferentes. Sin embargo, las observaciones que han reportado varios investigadores sugieren que el fenomeno es completado rapidamente: los cuerpos pueden formarse y desaparecer en un periodo de 24 horas.

ASPECTOS BIOQUIMICO-MOLECULARES DE LA APOPTOSIS

La apoptosis se considera como un proceso activo de suicidio celular. Una caracteristica comun de la apoptosis es la participacion activa de la celula en su propia aniquilacion, pues esta moviliza una cascada de eventos que conduce a su desintegracion. Existe considerablemente variacion en la senal inicial y los eventos metabolicos celulares necesarios para inducir apoptosis, que dependen en gran medida del tipo celular y de la naturaleza del evento externo el cual dispara la apoptosis. Las senales externas que conducen a este tipo de muerte son, probablemente, tan variadas como aquellas que conducen a la proliferacion y diferenciacion celular, y pueden incluir la supresion de senales extracelulares asi como su aparicion.

Ahora es ampliamente aceptado que la apoptosis es un proceso dirigido por genes y puede ser visto como uno mas de los procesos dirigidos por genes (igual que la diferenciacion), como parte del repertorio con que dispone la celula para responder a estimulos internos y externos (Williams, 1991; Ellis et al., 1991).

Influencia de genes reguladores

Algunos oncogenes y genes oncosupresores han sido ya identificados y se conoce que regulan la susceptibilidad celular para entrar en apoptosis. Hasta el presente hay datos convincentes relacionando a p53, c-myc, bcl-2, ced-4 y ras (Williams, 1991; Alions y Sarraj, 1992).

El gen supresor tumoral p53 y el proto-oncogen c-myc han mostrado tener efectos dramaticos sobre la apoptosis en algunas celulas. En timocitos, yprobablemente en algunos otros tipos celulares, p53 es un componente esencial de la via que conduce desde el dano al ADN hasta la apoptosis, aunque en otras celulas este puede conducir a la detencion del crecimiento y la reparacion del ADN. La restauracion de p53 funcional en celulas que no lo poseen normalmente, ya sea por mutaciones sensibles a temperatura o por transfeccion del gen bajo un promotor inducible, sugiere fuertemente que la expresion de p53 es suficiente para inducir apoptosis (Kastan et al., 1991).

El gen c-myc, al igual que el p53, es mas conocido como un elemento importante en el control de la proliferacion celular, pero su presencia consistente bajo condiciones de detencion del crecimiento, puede indicar la presencia de apoptosis (Bissonnette et al., 1992). Ademas, se ha observado que oligonucleotidos antisentido c-myc inhiben la muerte celular inducida por activacion de hibridomas de celulas T, sugiriendo que la expresion de c-myc endogeno es un requisito para la induccion de apoptosis en esta situacion (Gwyh et al., 1993). El gen c-myc puede, por lo tanto inducir ya sea proliferacion como apoptosis y la decision celular entre esas dos respuestas sera determinada por otras senales, como pueden ser la presencia de factores de crecimiento u otros estimulos de sobrevivencia.

Algunos proto-oncogenes celulares parecen rescatar del alto estado de recambio en la expansion celular; bcl-2 que es uno de ellos, es un oncogen encontrado en varias lineas celulares y tejidos que se caracterizan por presentar muerte celular por apoptosis. La expresion de bcl-2 puede inhibir la apoptosis inducida por varias situaciones de estres (Strasser et al., 1991). Sentman y colaboradores (Sentman et al., 1991) han demostrado la resistencia de los timocitos corticales para presentar apoptosis. Tales celulas fallan para sufrir apoptosis en respuesta a una amplia variedad de estimulos a los cuales normalmente son sensibles. Se ha demostrado que bcl-2 suprime la apoptosis en una amplia variedad de tipos celulares, aunque su sitio y el mecanismo molecular de accion es aun desconocido.

Horvitz y Yuan (1990) demostraron que ciertas mutaciones impiden la muerte celular durante el desarrollo de celulas especificas. Uno de esos genes expresados en las celulas agonizantes es ced-4, este gen ha sido recientemente secuenciado y clonado. Horvitz infiere de sus trabajos que ced-4 actua como continuo represor de la muerte celular y que la inactivacion de este libera el programa de muerte celular. Hay evidencias que sugieren que ced-4 es una proteina dependiente del calcio.

La alta expresion del oncogen ras mutado puede tener el mismo efecto que bcl- 2, es decir, puede incrementar la resistencia de la celula para presentar apoptosis.

Segundos mensajeros

La apoptosis es inducida cuando, ya sea un receptor de membrana o un mediador citoplasmatico, se une a un ligando, el cual provoca la generacion del segundo mensajero. Varios sistemas de segundos mensajeros han sido asociados con la induccion de apoptosis y la respuesta final varia con el estado metabolico de la celula y el tipo de celula en particular.

Un tipo de molecula receptora (APO-1/Fas) parece estar particularmente involucrada en el disparo de la apoptosis en algunos tipo celulares, incluyendo lineas celulares leucemicas (Itoh et al., 1991). Un ejemplo de ello son los linfocitos T. Se ha observado en estas celulas que la interaccion ligando-receptor puede conducir a una extraordinaria respuesta celular. En los timocitos corticales inmaduros CD4+ o CD8+, los ligandos que ocupan el receptor de la celula T inician la apoptosis, mientras que en celulas maduras postimicas entran a la fase S. Smith et al. (1989) han reportado recientemente evidencias de que la apoptosis de la celula blanco puede involucrar el acoplamiento del receptor de superficie celular APO- 1/Fas.

Hay reportes que senalan que el AMPc desempena tambien un papel importante en la apoptosis de timocitos y otros tipos de celulas linfoides. El efecto del AMPc es mediado por la proteina cinasa A (PKA) e involucra la activacion de AMPc-dependiente de proteina cinasa 1 (PK1). Otra via enzimatica que parece ser parte del mecanismo involucra la regulacion negativa de la muerte celular mediada por proteina cinasa (PKC)(CIGB, Cuba). Los esteres de forbol, los cuales activan PKC, protegen a los timocitos de la apoptosis inducida por los glucocorticoides, los ionoforos del calcio, el AMPc y la activacion del receptor de la celula T (Mc Conkey et al., 1989).

Recientemente se ha encontrado que muchas celulas en apoptosis expresan la actividad de una enzima transglutaminasa que se une a proteinas citoplasmicas. Parte del colapso y distorsion del contorno de la celula en apoptosis puede ser atribuida a la activacion de esta enzima (Wyllie, 1980). Sin embargo, el dramatico incremento en la densidad mostrado por las celulas cuando entran en la apoptosis se debe a unmovimiento neto de la salida de liquido. De hecho, el mecanismo responsable de la perdida de un tercio a un medio del volumen celular en el lapso de unos minutos, se debe a la inhibicion del sistema de co-transporte sodio-potasio.

Posteriormente a la colocacion de los cambios en la cromatina, el calcio libre citosolico se eleva y se mantiene sostenido, al menos en algunos tipos celulares, lo cual parece ser importante para el resto del proceso. No se conoce si la fuente de calcio es externa a la celula o interna (por ejemplo, de mitocondria)(McConkey et al., 1989). La importancia de este incremento en los niveles de calcio en la muerte celular es indicado por el hecho de que la inhibicion del incremento de calcio (por agentes farmacologicos) previenen la muerte celular. Se desconocen los cambios especificos inducidos por la elevacion de los niveles de calcio que causan la muerte celular. Existe la posibilidad de que el calcio active directamente a una enzima nucleasa, sensible al calcio-magnesio endogeno (endonucleasa) (Nelipovich et al., 1988; Compton y Lowsky 1992). Parece ser que el calcio actua directamente sobre esta enzima y que produce la ruptura de la cromatina en nucleosomas, de tal manera que el ADN de la celula en apoptosis se reduce a una serie de fragmentos.

Metodos de estudio para la identificacion de la apoptosis

Los microscopios de luz y el electronico ofrecen los mejores metodos para detectar celulas muertas y agonizantes, y permiten hacer morfologicamente una distincion entre necrosis y apoptosis. Sin embargo, esas tecnicas no nos permiten hacer una cuantificacion del fenomeno en una poblacion de celulas dada.

El dano celular, en celulas en apoptosis, muestra cambios morfologicos tipicos: condensacion nucleoplasmica consistente, fragmentacion nuclear y formacion de cuerpos apoptoticos. Estas alteraciones nos permiten utilizar diferentes metodos para la identificacion de este fenomeno.

La electroforesis de extractos de ADN en geles de agarosa es un metodo que se ha venido utilizando durante varios anos para identificar celulas en apoptosis. El extracto de estas celulas revela un modelo tipico de una fragmentacion del ADN en mono y oligonucleosomas, el cual es distintivo de la celula en apoptosis (Arends y Wyllie, 1991).

Varios articulos han descrito recientemente metodos de citometria de flujo para detectar celulas en apoptosis, pues algunas de las caracteristicas de este fenomeno permiten su analisis por este metodo. La ruptura del ADN extenso y la preservacion de la membrana celular son dos aspectos importantes de la celula en apoptosis, que proporcionan las bases para el desarrollo de la mayoria de los ensayos de citometria de flujo, y permiten hacer la discriminacion entre apoptosis y necrosis (Daarzynkiewicks et al., 1994).

La ruptura del ADN puede ser detectada por extraccion del ADN degradado (ADN de bajo peso molecular) de celulas prefijadas con etanol o permeabilizadas con detergentes, y la subsecuente tincion de la celula con fluorocromos para ADN. Las celulas en apoptosis muestran una reducida tincion del ADN (a causa del ADN de alto peso molecular). Alternativamente, los numerosos fragmentos rotos de ADN presentes en las celulas en apoptosis, pueden ser marcados en la reaccion con nucleosidos conjugados con biotina o digoxigenina, empleando deoxinucleotidil transferasa terminal exogena (TdT) o polimerasa de ADN (Schimtz, 1991).

Otros metodos de estudio de apoptosis estan basados en la identificacion de la preservacion de la membrana celular. La exposicion de celulas a tripsina y ADNasa permite la digestion de la celula con dano en la membrana celular. De esta manera se remueven las celulas muertas, pero no celulas en etapa temprana de apoptosis (Walker, 1993). La captacion del fluorocromo cationico RH123 es uno de esos metodos y es especifico para mitocondria funcionalmente activa: el colorante se acumula en mitocondrias en virtud de su potencial de membrana. La celulas con las mitocondrias y la membrana celular alteradas, concentran este colorante y exhiben fuerte fluorescencia. Este metodo esta basado en el analisis de la integridad de la membrana celular, como otros metodos basados en el mismo principio, permite discriminar entre celulas necroticas, celulas vivas y celulas en apoptosis (Darzynkiwvinz et al., 1992; Ormerod et al., 1993).

Recientemente ha sido publicado un metodo que se basa en la captacion del colorante bis-benzimidazole, Hoechst 33342, el cual usa celulas no fijadas, de modo que la poblacion de celulas en apoptosis pueda ser seleccionada para estudios morfologicos y bioquimicos posteriores. Hoechst 33342 es captado por celulas viables y se une a regiones ricas en AT. El metodo permite la observacion de algunos tipos de celulas en apoptosis ya que estas captan mas rapidamente el Hoechst 33342 que las celulas normales. Las celulas con membrana plasmatica danada, incluyendo las celulas necroticas, pueden ser distinguidas por adicion de yodo propidio (PI) el cual es excluido por las celulas viables (27).

Cada uno de los metodos presentados tiene sus ventajas y sus limitaciones. Los metodos basados sobre el analisis de la integridad y la funcion de transporte de la membrana celular, sin simples y de bajo costo, pero fallan para identificar celulas en apoptosis. Sin embargo, pueden ser usadas para identificar celulas necroticas, celulas con dano mecanico o en etapas muy tardias de apoptosis.

La identificacion de las celulas en apoptosis es muy compleja. Ninguno de los metodos descritos en la literatura, cuando se usan solos, pueden proporcionar una exactitud total de la deteccion de apoptosis. El mas especifico parece ser el metodo basado en la deteccion de los fragmentos de ADN rotos. El numero de fragmentos de ADN en celulas en apoptosis es tan grande que el grado de marcaje celular en este ensayo parece ser un adecuado discriminador entre celulas en apoptosis y en necrosis.

Un alto grado de exactitud en la identificacion de la celula en apoptosis puede ser obtenida por el uso de mas de un ensayo de viabilidad en la misma muestra. Debe quedar claro que, sin tomar en consideracion los metodos de citometria de flujo mencionados para la identificacion de apoptosis, este mecanismo de muerte celular debe ser confirmado por la inspeccion de la celula bajo microscopia electronica. Los cambios morfologicos durante la apoptosis tienen un modelo muy especifico y el analisis de la morfologia celular debe ser el factor decisivo en situaciones cuando hay alguna ambiguedad respecto al mecanismo de muerte celular.

Factores que inducen la apoptosis

EL papel tan importante que desempena la inhibicion y/o la induccion de la apoptosis en las enfermedades malignas y degenerativas es ampliamente reconocido (Herntz, 1993). Algunos agentes infecciosos han desarrollado mecanismos para contrarrestar el programa para el suicidio en las celulas infectadas. Sin embargo, tambien hay evidencias de que ambos, virus y bacterias, pueden activar el programa de apoptosis en la celula huesped como parte de su arsenal para causar enfermedad. Poco se sabe de los factores que inician la apoptosis o la naturaleza de los mecanismos celulares activados antes de la aparicion de los cambios morfologicos caracteristicos. Lo que esta claro, sin embargo, es que en ciertas cirscunstancias la apoptosis es un evento programado determinado por relojes intrinsecos especificos para el tipo de celula involucrada. A continuacion se describiran algunos de los factores involucrados en el desarrollo de la apoptosis, en procesos fisiologicos y patologicos.

Muchos agentes que inducen apoptosis, pueden ser oxidantes o estimuladores del metabolismo oxidativo celular. Las celulas de mamiferos se encuentran en un estado oxidativo en el cual la sobrevivencia requiere un apropiado balance de oxidantes y antioxidantes. Buttke y Sandstron (1994) proponen que, al menos en algunas situaciones, la tendencia de una celula a ir hacia la proliferacion o apoptosis dependera de su habilidad para mantener dicho balance. Estudios previos sugieren que la adicion de intermediarios oxigeno-reactivos (ROI) o la disminucion de antioxidantes celulares puede llevar a la apoptosis. Asimismo, se ha encontrado que la apoptosis puede ser bloqueada por la adicion de compuestos con propiedades antioxidantes.

Dentro del mecanismo de induccion de apoptosis por estres oxidativo, se senala que los intermediarios oxigeno-reactivos mitocondriales deben ser de particular importancia. Los niveles de ROI generados durante la fosforilacion determinara si la celula activada proliferara o sufrira de apoptosis. Dos procesos inmunologicos significativos donde la apoptosis mediada por estres oxidativo es de gran importancia son la activacion de la celula T y la patogenicidad del SIDA.

Maduracion de celulas T

Estudios tempranos han mostrado que los timocitos inmaduros son especialmente sensibles a la induccion de apoptosis (Egiston et al., 1990; Compton y Cid, 1992). En la mayoria de los casos su induccion es bloqueada, al menos temporalmente, por inhibidores de sintesis de proteinas y ARN, sugiriendo que la activacion de genes para la muerte celular es necesaria para la induccion del proceso. Existen evidencias de que la induccion de la apoptosis en los timocitos involucra un incremento sostenido en la concentracion del calcio citosolico.

La tolerancia timica depende de la induccion de apoptosis en timocitos inmaduros por el complejo antigeno/complejo de histocompatibilidad. La naturaleza de dicho complejo se desconoce. Lo que si esta claro es que la interaccion de la celula epitelial timica con el complejo antigeno/complejo de histocompatibilidad promueve la maduracion de timocitos doble positivo o celulas simple positivo (Teh et al., 1988). La intensa seleccion del repertorio de celulas T dentro del timo explica el alto nivel de muerte celular observado dentro del compartimiento de timocitos inmaduros, por tanto, la muerte celular programada(apoptosis) es esencial para el desarrollo intratimico normal de la celula T y de la tolerancia del organo mismo.

Recientemente se ha sugerido que el factor de necrosis tumoral (TNF) puede participar en la maduracion de timocitos normales. Puesto que la etapa intratimica de la celula T en desarrollo, se caracteriza tanto por una tasa alta de proliferacion como de muerte celular, es razonable determinar el papel del TNF en tales procesos. El TNF es una molecula dotada con una capacidad dual para matar ciertas celulas asi como para inducir la proliferacion en otras, Hernandez y Stutman (1993) sugieren que el TNF puede desempenar un papel regulador dual en la seleccion positiva y negativa intratimica. Ellos han mostrado que el TNF induce apoptosis directa en una fraccion de timocitos normales. Esos efectos del TNF in vitro sobre timocitos no son vistos con celulas T de sangre periferica. Se sabe que la estimulacion del receptor del TNF resulta en una rapida elevacion en los niveles intracelulares de ROI. Asimismo, se ha encontrado que la apoptosis inducida por TNF puede ser inhibida, ya sea por tioredoxina, un tiol intracelular reductor y atrapador de radicales libres, o bien por el uso de N-acetilcisteina (NAC) un tiol antioxidante y precursor de GSH que inhibe tambien el proceso. La hipotesis de que el TNF puede ser un componente en el proceso de seleccion del repertorio intratimico sigue bajo estudio. Sin embargo, es evidente que otros factores ademas del TNF pueden participar en la seleccion negativa intratimica, asi como tambien es factible que existan senales internas para la produccion de niveles fisiologicos de citocinas, importantes en la homeostasis linfoidea.

Ademas de los factores de crecimiento, algunas proteinas integrantes de la matriz extracelular han sido implicadas como moleculas que promueven el crecimiento, la proliferacion, el anclaje y la migracion de celulas hematopoyeticas, entre otras cosas. Por ejemplo, los progenitores linfoides y eritroides se unen a fibronectina, pero las celulas diferenciadas de ese linaje son incapaces de adherirse porque pierden la expresion de algunos receptores durante su madurez. Sugahara et al. (1994) en un estudio sobre los efectos de las moleculas de la matriz extracelular sobre celulas progenitoras hematopoyeticas encontraron que de varias moleculas estudiadas, la fibronectina induce dramaticamente la apoptosis. Tanto la inhibicion del crecimiento como la apoptosis inducida por fibronectina en celulas MO7E fueron abolidas por el tratamiento con anticuerpos anti-fibronectina o anti-VLA5. Los resultados sugieren la posibilidad de que la interaccion de fibronectina con su receptor puede contribuir, al menos en parte, en la hematopoyesis in vivo.

SIDA y apoptosis

Estudios recientes realizados por varios laboratorios han mostrado que durante la patogenesis del SIDA se dispara un programa de muerte celular (Gougion, 1993). Hallazgos recientes sugieren un nuevo mecanismo para explicar los defectos y disminucion de celulas auxiliares CD4+. En pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) se ha observado la presencia de apoptosis en una fraccion de celulas CD4+ y tambien CD8+ in vitro, tal muerte es asociada con la activacion de celulas T (Meyard et al., 1992). Sin embargo, esta activacion no resulta en proliferacion celular, sino mas bien en muerte celular, es decir, no solo las celulas infectadas con HIV pueden ser el blanco primario para la apoptosis, sino tambien esta se puede disparar en celulas activadas no infectadas. La muerte celular de celulas CD4+ y CD8+ es observada con posterioridad a la activacion de la celulas T por el principal complejo de histocompatibilidad (MHC). El reconocimiento de la importancia de la apoptosis en la patogenesis del SIDA puede tener consecuencias dramaticas para la concepcion de nuevas estrategias en el estudio y tratamiento para combatir la enfermedad.

Enfermedades infecciosas y apoptosis

Hay extensa evidencia de que la induccion de apoptosis contribuye directamente a la patogenesis de un gran numero de enfermedades virales, ademas del virus tipo 1 de inmunodeficiencia humana.

Recientemente Hinshow et al. (1994) han mostrado que todos los virus de la

influenza de mamiferos estudiados inducen apoptosis en celulas MDCK. La fragmentacion de ADN es comunmente inducida por el virus de la influenza. Sus estudios muestran claramente que cepas muy diferentes, incluyendo virus de influenza A y B, inducen esta respuesta celular. Celulas infectadas con virus muestran efectos citopatologicos siempre acompanados de la fragmentacion del ADN, tipicamente 3-6 h despues de la infeccion. Hay evidencias para una relacion entre proteinas virales especificas y una via de apoptosis involucrando bcl-2.

En la intrincada relacion entre las bacterias patogenas y su huespedes algunos patogenos han desarrollado vias para activar la muerte celular programada en eucariotes (Zychlinsky, 1993). Una de las especiesbacterianas que inducen apoptosis es Shigiella flexneir, un patogeno gram negativo que causa disenteria por invadir la mucosa colonica humana.

Recientemente, se reporto que el mecanismo de citotoxicidad de este patogeno es la induccion de apoptosis de macrofagos. Esta induccion dependera de la capacidad de la bacteria para escapar del fagolisosoma dentro del citoplasma. Un patogeno bacteriano que puede tambien actuar sobre la celula para llevarla a la apoptosis es el Helicobacter pylori, un patogeno involucrado en la gastritis cronica y la ulcera peptica. Otro patogeno que a juzgar por la morfologia de la celulas infectadas, tambien parece despertar la muerte celular es la Bordetella pertusis. Algunas exotoxinas de bacterias patogenas son capaces de inducir apoptosis, por ejemplo la toxina difterica, aunque el mecanismo molecular no esta bien claro.

La induccion de apoptosis bacteriana parece ser un factor patogenico importante en su citotoxicidad. pues mediante ese mecanismo atacan de manera efectiva a celulas de defensa del huesped, como los macrofagos y las celulas T, para desarrollar la enfermedad.

Terapia antitumoral y apoptosis

Aunque mucho se conoce acerca del mecanismo primario de accion de muchos agentes anticancer, incluyendo la localizacion de sus blancos primarios, no esta todavia claro como la interaccion con esos blancos debe conducir a la repentina o eventual muerte celular. Recientemente se ha sugerido que diversas drogas anticancer pueden inducir un modo se muerte celular, el cual tiene caracteristicas de apoptosis (Barry et al., 1990, Dive y Hickman, 1991). La induccion de apoptosis como una estrategia antitumoral ha alcanzado ya gran credibilidad. Entre las drogas que se sabe pueden inducir apoptosis estan: los inhibidores de la dihidrofolato reductasa, 5-fluouracilo, venenos de la topoisomerasa II y los agentes que danan el ADN. La mayoria de las drogas que inician la apoptosis reducen el potencial proliferativo. Cambios en la actividad especifica de proteinas regulada por el ciclo celular podrian, por lo tanto, representar un tipo comun de dano que proporcionaria el evento inicial para la cascada que inicia la muerte celular.

La existencia de un programa genetico para muerte celular inducida por drogas sugiere que las mutaciones de algunos genes podrian tener una profunda repercusion sobre la terapia, si las drogas son capaces de iniciar este proceso. Se ha senalado recientemente que es posible que este efecto de la quimioterapia puede ser determinado por la respuesta de la celula a la formacion de un complejo droga-blanco, y a sus secuelas, mas bien que a los cambios bioquimicos traidos por la misma droga (Dive et al., 1992). Una de esas respuestas, determinada por el fenotipo de la celula puede ser la activacion de un programa genetico para la muerte celular.

CONCLUSION

Hasta hace menos de 10 anos el significado de muerte celular programada (apoptosis) no fue completamente reconocido por la mayoria de los investigadores en el area de las ciencias biologicas. El estudio de la apoptosis, sin embargo, esta progresando ahora rapidamente, tanto a nivel celular como molecular. El significado del proceso esta adquiriendo cada vez mas importancia por su participacion en la regulacion de procesos fisiologicos y patologicos. Que factores determinan cuales celulas seran afectadas? Que papel desempena la edad? Cual es el modo de accion de algunos iniciadores o inhibidores? y Que otros mecanismos bioquimicos y morfologicos estan implicados? Estas son algunas de la interrogantes que quedan por resolver, y que hacen de este fenomeno un campo muy interesante por investigar. Con motivo de que la apoptosis es un evento importante en el control de poblaciones celulares especificas, es por tanto facil predecir que la regulacion de la apoptosis sera de gran utilidad para muchas aplicaciones terapeuticas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren expresar su gratitud a la Srta. Veronica Alvarez Duran por su asistencia secretarial y a la Q. Aurora Acosta por sus acertadas criticas al texto.

REFERENCIAS

ALIONS, M.R. and C.E. SARRA (1992). Apoptosis: A gene directed programme of cell death. J.R. Cell.Physicians Lond. 26:25-35.

ALLEN, T.D. (1989). Ultraestructural aspects of cell death. In Perspectives on Mammalian Cell Death C.S. Potten ed. 39-65. Oxford University Press, USA.

ARENDS, M.J.; R.J. MORRIS and A.H. WYLLIE (1990). Apoptosis: the role of endonuclease. Am. J.Pathol. 136:593-608.

ARENDS, M.J. and A.H. WYLLIE (1991). Apoptosis: Mechanisms and roles in pathology. Int.Rev.Exp.Path. 32:223-254.

BARRY, M.A.; C.A. BEHNKE and A. EASTMAN (1990). Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anticancer drugs, toxin and hypertermia. Biochem Pharmacal. 40:2353-2358.

BISSONNETE, R.F.; F. ECHEVERRI; A. MAHBOUBI and A.R. GREEN (1992). Apoptotic cell death induced by c-myc is inhibed by bcl-2. Nature. 359:552-554.

BUTTKE, T.M. and P.A. SANDSTROM (1994). Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunology Today. 15:7-10.

COHEN, J.J. (1994). Apoptosis: El proceso fisiologico de muerte celular. Hospital Practice 3(10):439-448.

COHEN, J.J., (1991) Programmed cell death in the immune system. Adv. Immunol. 50:5-85.

COLLINS, M. (1991). Death by a thousand cuts. Curr. Biol. 3:140- 142.

COMPTON, M.M.A. (1992). Biochemical hall mark of apoptosis-internucleosomal degradation of the genoma. Canc. Metast. 11:105-119.

COMPTON, M.M. and J.A. CID LOWSKY (1992). Thymocyte apoptosis-a model of programmed cell death. Trends Endo. 3:17-23

DARZYNKIEWICKS, Z.; S. BRUNO; G. DEL BINO (1992). Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry 13:795-808.

DARZYNKIEWICKS, Z.; H.A. CRESSMAN; J.R. ROBINSON (1994). Methods in Cell Biology: Flow cytometry (2nd Edition). Academic Press, N.Y.

DIVE, C. and J.A. HICKMAN (1991). Drug-target interactions: only the first step in the commitment to a programmed cell death. Drug targets interactions.

EGISTON, M.; R. SCOLLAY; K. SHORTMAN (1980). Kinetics of mature T-cell development in the thymus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:2579- 2582.

ELLIS, R.E., J. JUAN and H. R.HORWTZ (1991). Mechanisms and functions of cell death. Ann Rev. Cell Biol. 7:663-698

GOUGION, M.L. (1993). Apoptosis in AIDS. Science 268:1269- 1272.

GWYHT, W. and A. CHRISTOPHER (1993). Molecular regulation of apoptosis: genetic control on death. Cell. 74:777-779.

HERNANDEZ, T. and O. STUTMAN (1993). Imnune junctions of tumor necrosis factor. Tumor necrosis factor induces apoptosis os mature thymocyts and can also stimulate or inhibit IL-6 induced proliferation depending on the concentration of metogenic co-stimulation. J. of Immunology 151(8):3999-4012.

HERNTZ, N. (1993). Cell death and the cell cycle: a relationship between transportation and neurodegeneration? TIBS 18:157-159

HINSHOW, V.S.; C.W. OLSEN; N. DYBDAHL-SISSOKO and D. EVANS (1994). Apoptosis: a mechanism of cell killing by influenza A and B viruses. J. of Virology 68(6):3667-3673.

HORWITZ H.R. and J.YUAN (1990). The Caenorhabditis elegans genes ced-3 y ced-4 cell autonomously to cause programmed cell death. Dev.Biol. 138:33-41

ITOH N., S. YONEHARA; A. ISHII; M. YONEHARA; S.L. MIZUSHIMA; M. SAMESHIMA; A. ITASE; S. YOSHIYUK and S.NAGATA (1991). The polypeptide encoded by the cDNA of human cell surface antigen fas can modulate apoptosis. Cell 66:233-243.

KASTAN M.B.; O. OHYERWERE; D. SIDRANSKY; B.VOGELSTEIN and R.W. CRAIG (1991). Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51:6304-6311.

KERR, J.F.R.; D.H. WYLLIE and A.R. CURRIE (19972). Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranning implications in tissue kintetics. BR.J. Cancer 26:239-257.

McCONKEY, D.J.; P.HARTZELL; M.JONDAL and s. ORRENIUS (1989). Inhibition of DNA fragmentation in thymocytes and isolated thymocyte nuclei bay agents that stimulate protein kinase C. J.Biol. Chem. 264:13399-13402.

McCONKEY, D.J.; P. NICOTERA; P.HARTZELL; G. BELLOMO; A.H. WYLLIE and S. ORRENIUS (1989). Glucocorticoidsactive a suicide process in thymocytes through an elevation of cytosolic calcium concentration. Arch Biochem & Biophys 269:365-370.

MEYARD, L.; S.A. OTLO; R.R. JONKER; M.J. MINJNSTER; R.P. KEET and F. MIEDEMA (1992). Programme death of T cell in HIV-1 infection. Science 257:217-219.

NELIPOVICH, P.A.; L.A. NIKONOVA and S.R. UMANSKY (1988). Inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase as a possible reason for activation of Ca2+/Mg2+ dependent endonuclease in thymocytos of irradiated rats. Int. J.Radiar. Biol. 53:749-765.

ORMEROD, M.G.; X.M. SUN; D. BROWN, R.T. SNOWDEN and G.M. COHEN (1993). Quantification of apoptosis and necrosis by flow cytometry. Acta oncologica 32(4):417-424.

SAUNDER, J.W. (1966). Death in embryonic systems. Science 154:604-612.

SENTMAN, C.L.; J.R. SCHUTTER; D. HOCKENBERG; D. KANAGA and S.S. KORSMEYER (1991). Bcl-2 inhibits multiples form of apoptosis but not negative selection in thymocytes. Cell 67:879-888.

SCHIMTZ, G. (1991). Non radiactive labelling of oligonucleotides in vitro with the hapten digoxigenin by tailing with terminal transferase. Anal. Biochem. 92:222-231.

SMITH, C.A.; G.T. WILLIAMS; R. KINGSTONE; E.J. JENKINSON; J.J.T. OWEN (1989). Antibodies to CD3/T receptor complex induce cell death by apoptosis in immadute thymic culture. Nature 337:181-184.

STRASSER, A.; S. WHITTINGHAM; D.L. VAUX; M.L. BATH; J.M. ADAMS; S. CORY and A.Q. HARRIS (1991). Enforcial Bcl-2 expression in b-lymphayd cells prolongs antibody responses and elicits autoimmune disease. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:8661-8665.

SUGAHARA, H.; H.KAMAKURA; T. FURUTSU; J. SOHIKAWA; K. HASHIMOTO; Y. KANAYAMA and Y. MATZUZAWA (1994). INDUCTION of programmed cell death in human hematopoietic cell lines by fibronectine via its interaction with very late antigen 5. J. Exp. Med. 179:1757-1766.

THE, S.H.; P. KISIELOW; B. SCOTT; H. KEISHE; Y. URMATSU; H. BLETHMANN and V.H. BOEHMER (1988). Thymic major histocompatibility complex antigens and the T- cell receptor determine the CD4/CD8 phenotype of T cell. Nature 335:229-233.

THOMPSON, H.J. (1992). Apoptosis in the genesis and prevention of cancer. Cancer Epidem. Biomarkers and prrevention 1:597-602.

WALKER, N.I.; B.V. HARMAN; G.C. GOBE; J.F.R. KERR (1988). Paterns of cell death, Methods Achiev. Exp. Pathol. 23:18-54.

WALKER, P.R. (1993). Detection of the initial stages of DNA fragmentation in apoptosis. Biotechniques 15:1032-1047.

WILLIAMS, G.T. (1991). Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis. Cell 65:1097-1098.

WYLLIE, A.H.; R.G. MORRIS; L.A.SMITH and D. DUNLOP (1984). Chromatin cleavage in apoptosis asociation with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis. J. Pathol. 142:67-77.

WYLLIE, A.H. (1980). Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associted with endogenous endonuclease activation. Nature 284:555-556.

Copyright 1995 Sociedad Iberolatinoamericana de Biotecnologia Aplicada a la Salud