Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 1, 1995, pp. 23-29

ARTICULO ORIGINAL CORTO SHORT ORIGINAL PAPER

GENERACION DE UN HIBRIDOMA DE RATON SECRETOR DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA EL ANTIGENO DEL GRUPO SANGUINEO A DEL SISTEMA ABO HUMANO.

Rene A. Rivero Jimenez, Lilia E. Suarez Batista, Antonio A. Bencomo Hernandez, Renee Gonzalez Sampedro, Juan M. Gonzalez Gonzalez, Lourdes E. Palma Salgado, Amarylis Salazar Antunez.

Instituto de Hematologia e Inmunologia, Apartado postal 8070, Ciudad de La Habana, C.P. 10800, Cuba.

Code Number: BA95004
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Recibido en enero de 1994. Aprobado en diciembre de 1994

Key words: Hybridoma, blood groups, monoclonal antibodies, ABO system.

SUMMARY

Female Balb/c mice were immunized with blood group A (Aint variant) erithrocytes using our own booster schedule. Spleen cells from the immunized mice were fused with mouse cells of the P3-X63.Ag8.653 myeloma cell line. Screening of culture supernatants by a microplaque hemagglutination techniques revealed one hybridoma to be secreting a particularly potent anti-A antibody. This new murine monoclonal antibody (IHI- 15) has been evaluated and found suitable as a blood-grouping reagent. Ascitic fluid derived from this hybridoma cell line contains a potent, avid, specific and sensitive antibody as demonstrated by its reactivity with a sample of 302 blood donors and 48 cord blood samples tested manually by three different methods and all were correctly grouped using this antibody. No false-positive reactions were obtained with papainized group B cells. Reagent prepared from IHI-15 detected most examples of A and all other A subgroups and A variants tested.

RESUMEN

El trabajo consistio en la inmunizacion de ratones Balb/c con hematies humanos del grupo sanguineo A (variante Aint) usando nuestro propio esquema de sensibilizacion; se fusionaron esplenocitos de los ratones inmunes con la linea de mieloma de raton P3-X63.Ag8.653, se seleccionaron clones de celulas hibridas secretoras de anticuerpos utilizando para el pesquisaje de los sobrenadantes de cultivo una tecnica de hemaglutinacion en microplacas, lo que revelo un clon secretor de anticuerpos anti-A particularmente potentes. Este nuevo anticuerpo monoclonal murino (IHI-15) se evaluo y resulto adecuado como reactivo hemoclasificador. El liquido ascitico derivado de este hibridoma contiene anticuerpos potentes, con avidez y especificidad, como se demostro por su reactividad frente a una muestra de 302 donantes de sangre y 48 de sangre de sangre de cordon umbilical que se probaron manualmente por tres metodos, todas clasificadas correctamente con el uso de este anticuerpo. No se encontraron resultados falso-positivos cuando se evaluaron eritrocitos del grupo B tratados con papaina. El reactivo preparado a partir del clon IHI-15 detecto a la mayoria de las muestras Ax y de otros subgrupos y variantes de A evaluadas.

INTRODUCCION

En los seres humanos existen cuatro fenotipos principales de grupos sanguineos dentro de la clasificacion del sistema ABO, que son: los fenotipos A, B, O y el AB. Su importancia es decisiva para la transfusion inocua de sangre o globulos. Estos simbolos fenotipicos designan la presencia o la ausencia de los antigenos A y B. Las personas con sangre del tipo O poseen un antigeno que se designa con el simbolo H, y en muy raras ocasiones se encuentra un individuo H-negativo, cuyo grupo sanguineo se define como Bombay. Dentro del grupo sanguineo A, existen a su vez dos subgrupos importantes (A1 y A2) definidos estos por la reaccion de los hematies con la lectina anti-A Dolichos biflorus (grupo A1) y la lectina anti-H Ulex europeaus (grupo A2) y una variante intermedia que reacciona con ambos reactivos (variante Aint), junto a otras variantes menos comunes.

Aproximadamente el 80% de los individuos no solo poseen antigenos de grupos sanguineos en la superficie de sus celulas, sino que tambien segregan una forma hidrosoluble de antigenos A, B o H en su saliva y en otros liquidos tisulares de excrecion. Casi todas las personas que poseen sangre del tipo A, B u O presentan en su suero anticuerpos (isohemaglutininas) contra los antigenos A o B cuando estos no forman parte de sus celulas; asi, las personas del grupo A presentan generalmente anticuerpos naturales anti-B, las del grupo B presentan anticuerpos anti-A, las del grupo O presentan anticuerpos anti-A y anti-B, mientras que las del grupo AB no exhiben este tipo de anticuerpos (1).

La produccion de antisueros policlonales confiables y de alta calidad para el tipaje de sangre es una tarea laboriosa y larga, y cada vez con mayor frecuencia depende de la inmunizacion de seres humanos que despues se utilizan como donantes especiales para producir, a partir de su sangre, este tipo de reactivos, lo que entrana toda una serie de problemas, incluyendo aspectos eticos, medico-legales y epidemiologicos (3), por el riesgo de transmision de determinadas infecciones por via sanguinea (hepatitis B, hepatitis C, HTLV-I/II, citomegalovirus, virus de la inmunodeficiencia humana, etc.) y por la frecuencia con que aparecen en estos donantes enfermedades de tipo autoinmunes.

Por estas razones, la aplicacion de la tecnologia de hibridomas desarrollada por Kohler y Milstein (4) para la produccion de anticuerpos monoclonales murinos (AcM) con aplicacion como reactivos hemoclasificadores desperto un elevado interes y una prueba de ello es que ya se han efectuado dos talleres/simposios internacionales sobre este tema, uno en Paris (1987) (5) y otro en Lund, Suecia (1990) (6); sin embargo, la sustitucion de los reactivos policlonales por monoclonales no es una tarea facil. El problema radica en la naturaleza tanto de los anticuerpos como de los antigenos involucrados en esta reaccion (7).

Los antigenos de grupos sanguineos no son proteinas, sino oligosacaridos cuya presencia y ubicacion en la membrana eritrocitaria depende de enzimas codificadas geneticamente, por ejemplo, los dos principales subgrupos dentro del grupo A se deben a una diferencia en la expresion de los determinantes A (N- acetil galactosamina), las celulas A1 poseen 1x10^6 determinantes A, mientras que las celulas A2 tienen solo 2,5 x 10^5. Tanto los genes A1 como los A2 codifican para la alfa-3-N-acetil- galactosaminil transferasa, pero esta enzima difiere en sus propiedades cineticas y la transferasa codificada por los genes A2 es generalmente menos eficiente (8), pero al parecer, no solo existe una diferencia cuantitativa, sino que se ha comprobado que las celulas A1 tienen una estructura H tipo 2 extendida diferente a la de las celulas A2 (8).

Aunque los AcM murinos contra antigenos de los grupos sanguineos del sistema ABO se han utilizado como reactivos hemoclasificadores, esto generalmente se ha logrado creando mezclas de anticuerpos (9). Idealmente, estos anticuerpos deben tener una alta avidez y potencia, deberian detectar a todas las variantes debiles del antigeno A, entre ellas a las variantes Ax. Estas caracteristicas son muy poco frecuentes en un solo anticuerpo y de hecho, la mayoria de los AcM comerciales anti-A que cumplen con ese criterio son una mezcla de mas de un AcM (9). Incluso, los sueros hemoclasificadores policlonales obtenidos del suero de donantes del grupo B no necesariamente detectan a estas variantes, y por lo tanto, usualmente se utilizan sueros policlonales anti-AB (de donantes del grupo O) para que las variantes Ax sean detectadas (10).

Por otra parte, reportes recientes indican que ciertos AcM anti-A que detectan a las variantes Ax ofrecen una reaccion no deseada, porque estos reactivos son tan potentes que pueden aglutinar a hematies del grupo B que expresan cantidades minimas del antigeno A en su superficie (11-13). La deteccion de este llamado fenomeno B(A) por tales anticuerpos podria dar lugar a un tipaje ABO incorrecto cuando no se realiza la prueba cruzada con el suero, como en los casos de retipaje de donantes, tipaje de sangre de cordon umbilical, o de recien nacidos. Otro informe indica que en el segundo taller/simposio internacional sobre AcM contra grupos sanguineos y antigenos relacionados, se presentaron a evaluacion un total de 16 AcM con especificidad anti-A, de los cuales ninguno era capaz de detectar a la variante debil Ael. Estos AcM se agruparon segun su reactividad en 6 categorias y solo los de las categorias 1 y 2 eran capaces de detectar a algunas muestras de las variantes Ax (14).

MATERIALES Y METODOS

Generacion de hibridomas

Los hibridomas se desarrollaron a partir de una fusion de la linea de plasmacitoma de raton P3-X63.Ag8.653 (X63) y esplenocitos de un raton Balb/c inyectado con hematies completos con fenotipo Aint obtenidos a partir de la sangre periferica de un donante fenotipado con la ayuda de lectinas y reactivos hemoclasificadores policlonales humanos. El raton se inyecto segun un esquema de inmunizacion desarrollado por nuestro laboratorio, en cuatro ocasiones distintas a intervalos de 7 dias para las tres primeras dosis y 10 dias para la ultima, y se sacrifico tres dias despues de la inyeccion final. La dosis de hematies en cada inyeccion fue de 4 x 10^7 celulas en 0,5 mL por via intraperitoneal.

La fusion celular se realizo a temperatura ambiente segun una modificacion al procedimiento de Galfre et al (15): se unieron 37,2 x 10^7 esplenocitos no lavados con 7,3 x 10^6 celulas del mieloma que se cultivaron previamente en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado, con medio sin suero en tubos de ensayo de poliestireno esteriles con tapa de rosca de 50 mL de capacidad, se centrifugaron a 470 x g durante 7 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 25 C) y una vez eliminado el sobrenadante totalmente, se le adiciono 1 mL de una solucion de polietilen glicol 1500 (PEG 1500) al 50% en solucion amortiguada con HEPES (75 mM), pH 7,2 a temperatura ambiente con incubacion inicial de 1 minuto, y agitacion suave, despues de la cual, se inicio la adicion subsecuente de solucion amortiguadora de fosfatos (SAF) en proporciones de 100 uL cada 20 segundos durante el segundo minuto de incubacion, cada 15 segundos durante el tercer minuto, cada 10 segundos durante el cuarto minuto, cada 5 segundos durante el quinto minuto, y para finalizar la dilucion del PEG 1500, se anadio SAF hasta completar un volumen de 10 mL, luego se centrifugo el tubo de ensayo a 30 x g durante 7 minutos a temperatura ambiente y se elimino totalmente el sobrenadante, mientras que el boton celular que contenia las celulas fusionadas, se resuspendio suavemente en un pequeno volumen de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB inactivado, L-glutamina (0,3 g/L), piruvato de sodio (1mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0,1 mg/mL), anfotericina B (0,25 mg/mL), hipoxantina (10^-4 M), aminopterina (4 x 10^-5 M), timidina (1,6 x 10^-5 M), e insulina (20 UI/mL) (medio HAT- I), con HEPES (15 mM) y bicarbonato de sodio (2 g/L) como amortiguadores, y posteriormente se completo con dicho medio hasta obtener una concentracion final de 2 x 10^6 celulas/mL, que se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos que contenian una monocapa de celulas alimentadoras compuesta por macrofagos de la cavidad peritoneal de ratones singenicos, las placas se incubaron a 37^C en atmosfera humeda y CO2 al 5%, con estrictas medidas para el mantenimiento de la esterilidad de los cultivos, cuatro dias mas tarde, se elimino totalmente el sobrenadante en cada pocillo y los cultivos se realimentaron con el mismo medio; a los 8 dias de la fusion se inicio el pesquisaje de anticuerpos en los sobrenadantes con el empleo de volumenes de 0,1 mL para cada estudio y renovacion total del medio de cultivo cada 4 dias a partir de esa fecha.

Caracterizacion serologica inicial

El pesquisaje inicial de anticuerpos se realizo por la tecnica de hemaglutinacion en microplacas de 96 pocillos con fondo en U utilizando un panel de hematies humanos al 2% tratados con bromelina a 37 C de los fenotipos A1, A2 Ax, B y O, en proporcion volumen a volumen segun el metodo recomendado por Voak D et al (16).

Clonaje celular

Los clones se re-clonaron tres veces por dilucion limitante para garantizar la monoclonalidad del producto final.

Obtencion de liquido ascitico

Tambien se obtuvo liquido ascitico del clon mencionado, mediante la inoculacion de 107-106 celulas en la cavidad peritoneal de ratones Balb/c que habian recibido un dia antes 0,5 mL de adyuvante incompleto de Freund.

Caracterizacion inmunohematologica

Con el liquido ascitico se realizaron pruebas de especificidad, potencia, avidez, y comprobacion de la ausencia de anticuerpos contaminantes, segun los metodos recomendados por la Oficina de Alimentos y Drogas (FDA) del Gobierno de los Estados Unidos de America (17, 18) y reconocidos por la Sociedad Internacional de la Transfusion Sanguinea y el Comite Internacional de Normalizacion en Hematologia (19).

Pruebas serologicas

Tecnica de centrifugacion en tubos: Se colocaron 0,1 mL de la suspension de hematies al 2% y de cada dilucion del liquido ascitico en tubos 10 x 75 mm, se mezclaron e incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugaron 1 minuto a 100 x g. El boton celular se despego cuidadosamente y la aglutinacion se observo macroscopicamente. La intensidad de la reaccion de hemaglutinacion se graduo segun el metodo de

Marsch (20) (escala de 0 a 4+). El punto final de la titulacion se considero como el reciproco de la maxima dilucion que ofrece una reaccion 1+.

Determinacion de la especificidad y la potencia

La especificidad tanto en sobrenadantes como en el liquido ascitico se determino por la tecnica anterior, usando hematies tratados con enzimas (bromelina y papaina) y sin tratar. La potencia se determino por titulacion, de las diluciones dobles del liquido ascitico en solucion salina fisiologica y con pruebas frente a un panel de celulas de fenotipos comunes y raros: A1, A2, Ax, A1B, A2B, A3B, AxB, B y O. Para comprobar la ausencia de reactividad frente a otros grupos sanguineos, se emplearon hematies que expresan los siguientes fenotipos Le^a, Le^b, I, K, k, Kp^b, Js^b, P1, D, C E, c, e, M, N, S, s, Lu^b, JK^a, JK^b, Fy^a, Fy ^b, y Wr^a.

Pruebas de inhibicion para comprobacion de la especificidad

Las pruebas de inhibicion para comprobar la especificidad de los AcM se realizaron tanto con saliva de individuos secretores de sustancia A y sustancia B hidrosoluble, como con estas sustancias obtenidas de meconio, se incubaron 500 mL de liquido ascitico con un volumen igual de saliva tratada y con sustancia A y sustancia B obtenida de meconio, durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se tomaron 50 mL de diluciones del liquido ascitico y se enfrentaron a hematies de prueba A1 (volumen a volumen) para detectar actividad aglutinante. Como control negativo se uso el mismo liquido ascitico incubado con solucion salina sin estas sustancias.

Determinacion de la avidez y la intensidad de la reaccion

Diluciones del liquido ascitico en solucion salina fisiologica, se probaron frente a un panel de hematies A1, A2B, y Ax, usando suspensiones altamente concentradas de estas celulas. Una gota de la suspension celular se coloco en un pocillo excavado y se mezclo con una gota de liquido ascitico diluido, con un reloj cronometro se midio el tiempo en segundos hasta la aparicion de una aglutinacion 3+. Para conocer la intensidad de la reaccion, al completar un minuto, se evaluo el tamano de los grumos de aglutinacion, segun la escala de Marsch (19). Para obtener las condiciones idoneas de concentracion salina y pH del reactivo hemoclasificador monoclonal anti-A (producto final), formulado a partir de la dilucion optima del liquido ascitico derivado del clon IHI-15, se evaluo el efecto sobre la avidez y la intensidad de las siguientes concentraciones de ClNa: 9 - 13 - 17 - 21 - 25 - 29 g/L frente a hematies de los fenotipos A1, A2, Ax, A2B, y AxB, y los siguientes pH: 5,7 - 6 - 6,5 - 7 - 7,5 - 8 en SAF 0,1 M con hematies A1 y A2.

Determinacion de la clase y subclase de las inmunoglobulinas de raton

Por doble inmunodifusion radial se determino la clase y subclase de las inmunoglobulinas de raton secretadas por este clon.

Aplicacion de los AcM como reactivos hemoclasificadores

Con reactivos formulados a partir de la dilucion optima del liquido ascitico en SAF 0,1 M, pH 7,5, 17 g/L de ClNa, 0,1% de azida sodica, 1% de albumina serica bovina y con la adicion del colorante erioglaucina (30 g/L) en una dilucion 1:200, se aplico el AcM anti-A para la determinacion de grupos sanguineos en 302 muestras de donantes de sangre que acudieron al servicio de transfusiones del Instituto de Hematologia e Inmunologia y en 48 muestras de sangre de cordon umbilical (con expresion debil de los antigenos), colectadas en el servicio de Gineco-Obstetricia del Hospital General Docente "Enrique Cabrera", en paralelo con un reactivo hemoclasificador anti-A policlonal humano de produccion nacional, por los metodos de hemaglutinacion por centrifugacion en tubos, en laminas portaobjeto, y en microplacas de 96 pocillos con fondo en U, para determinar la especificidad y la sensibilidad del producto final. Ademas se enfrento a muestras de hematies de algunos individuos que representan a las siguientes variantes debiles: Ael, Am-like, A1,2B, Ao,oB, A2B, A3B, Ax, y Aend.

RESULTADOS

Este trabajo proporciono AcM murinos (IHI-15) que se unen selectivamente a un epitope especifico de la membrana de los hematies A y AB que expresan el antigeno A.

De los hibridomas obtenidos se seleccionaron 14 clones que reconocen a los grupos sanguineos A y AB (Tabla 1), de los cuales finalmente se escogio el clon IHI-15 anti-A para su caracterizacion serologica y molecular. Este clon se re-clono tres veces por dilucion limitante para garantizar la monoclonalidad del producto final.

Tabla 1

Reactividad de los sobrenadantes de 14 clones IHI frente a hematies humanos de diferentes fenotipos*

     Sobrenadantes Fenotipo de los hematies de prueba
     Clones
                   A1     A2    Ax    B     O
     IHI-3          +     +     +     -     -
     IHI-11         +     -     -     -     -
     IHI-12         +     +     +     -     -
     IHI-13         +     +     +     -     -
     IHI-14         +     -     -     -     -
     IHI-15         +     +     +     -     -
     IHI-24         +     +     -     -     -
     IHI-32         +     +     +     +     -
     IHI-33         +     +     +     +     -
     IHI-34         +     +     +     +     -
     IHI-38         +     +     +     +     -
     IHI-39         +     +     +     +     -
     IHI-44         +     +     -     -     -
     IHI-47         +     +     -     -     -

*Con la tecnica de hemaglutinacion en microplacas y por
centrifugacion en tubos
     

Clon Seleccionado

Los resultados de las pruebas de especificidad, titulo, pruebas de inhibicion con saliva y con sustancia A y B obtenida de meconio, avidez, e intensidad se muestran en las Tablas 2, 3, y 4.

Tabla 2

Especificidad y titulo de hemaglutininas en el liquido ascitico derivado del clon IHI-15 frente a un panel de hematies humanos de distinto origen y fenotipo

                                  Origen

     Fenotipo       Sangre Periferica  Sangre de Cordon 
                      Adultos            umbilical
     ----------------------------------------------------
               n     R     Titulo     n     R     Titulo
     ----------------------------------------------------
     A1        3     +     262 144    5     +     65 536
     A2        3     +     4 096      1     +     NR
     Ax        2     +     4 096           NR     
     A1B       1     +     32 788     4     +     8 192
     A2B       3     +     16 384     2     +     NR
     AxB       1     +     8 192           NR     
     B         4     -     -     1    -     -     -
     O         3     -     -     2     -     -    -

n: Numero de muestras evaluadas
R: Reactividad
NR: No realizado

Reactividad del liquido ascitico del clon IHI-15 en pruebas de inhibicion con sustancias A y B obtenidas de saliva y meconio frente a hematies del subgrupo A1

               Diluciones del liquido ascitico

Incubacion con                   200^-1  400^-1  800^-1  1 600^-1
Sustancia A secretada en saliva     1+     -      -       -
Sustancia B secretada en saliva     4+     4+     4+      4+
Sustancia A obtenida de meconio     1+     -      -       -
Sustancia B obtenida de meconio     4+     4+     4+      4+
Salina sin sutancia                 4+     4+     4+      4+
     

Pruebas de avidez e intensidad de los anticuerpos secretados por el clon IHI-15 frente a los hematies de prueba

     Liquido               Panel de hematies
     ascitico     Prueba     A1     A2B     Ax
------------------------------------------------
Dilucion
32^-1             Avidez     2"      4"     35"
"(segundos)   

En salina       Intensidad   4+      2+      1+
al minuto 
     

Tabla 5

Avidez e intensidad de reactivos hemoclasificadores formulados con ascitis del clon IHI-15 anti-A con diferentes concentraciones de NaCl y pH en la solucion amortiguadora de fosfatos 0,1 M

Fenotipo    A   I   A    I    A   I    A    I   A   I  A   I
de                    Concentracion de NaCl (g/L)
Henaties    ----------------------------------------------------
              9       13        17       21       25    
 29
----------------------------------------------------------------
A1 n = 2   2,5  3   1,75  3   2   3   2,75  3   3,5  4   6   4
A2 n = 2   5    1   3     3   3   3   4,5   2   7    2   9   2

Ax n = 2   3,8  1  51,5   1  31   1      ND        ND      ND
A2Bn = 2   7,5  2   9     3   7,5 3   7,5   2      ND      ND
AxBn = 2  36    1  33     1  17   1  39     1      ND      ND

                           pH SAF 0,1 M
             5,7       6       6,5       7        7,5       8
            ----------------------------------------------------
A1 n = 2     5  3   4     3   4   3   3     3   2,5  9  3,5 
3
A2 n = 2     7  1  14     1   4   2   3,5   2     4  2  3,5  1

A: Avidez en segundos
I: Intensidad en +
Concentracion de hematies: 10%
Dilucion de la ascittis: 16^-1
ND: No definido

Cuando el liquido ascitico del clon IHI-15 se enfrento a una muestra de 10 hematies del grupo B tratados con papaina, no se detecto ninguna reaccion falso-positiva por los metodos de hemaglutinacion descritos anteriormente.

No se encontraron anticuerpos contaminantes ni reacciones cruzadas cuando el AcM se evaluo frente al panel compuesto por los hematies de los siguientes fenotipos: Lea, Leb, I, K, k, Kpb, Jsb, P1, D, C, E, c, e, M, N, S, s, Lub, JKa, JKb, Fya, Fyb, y Wra. Se determino que el AcM IHI-15 es una inmunoglobulina de raton clase IgM. La posible utilidad como reactivo hemoclasificador se basa en la capacidad para reaccionar por los metodos internacionalmente establecidos con los hematies humanos, ya que en el estudio realizado en 302 muestras de sangre periferica de donantes adultos y en 48 muestras de sangre de cordon umbilical se encontro un 100% de especificidad y sensibilidad cuando se comparo con el reactivo de referencia anti-A policlonal humano de produccion nacional (Tabla 6).

Tabla 6

Reactividad del AcM IHI-15 hemoclasificador anti-A frente a muestras de sangre de adultos y de cordon umbilical segun grupos sanguineos en comparacion con similar policlonal

               Sangre periferica           Sangre de cordon
          -------------------------   ---------------------------
Grupo     n         % de reactividad   n         % de reactividad
                        con anti-A                  con anti-A
                   ^*AcM   IHI-15               ^*AcM   IHI-15
                    polyclonal                  polyclonal
-----------------------------------------------------------------

A         125      100      100        11        100      100
B          44        0        0         8          0        0
AB          6      100      100         5        100      100
O         127        0        0        24          0        0
          302                          48          
* Por tres metodos de haemoglutinacion

La reactividad frente a algunos individuos que representan a las variantes debiles indico que este AcM reconoce a hematies de los siguientes fenotipos: Ael, Am-like, Ao,oB, A1,2B, A2B, A3B y Ax, y no reconoce a los hematies de la variante Aend.

DISCUSION

Las considerables ventajas que los reactivos hemoclasificadores basados en AcM poseen sobre los reactivos policlonales humanos convencionales se han informado tambien por otros autores (21- 23). Los AcM anti-A producidos en los ultimos anos en el extranjero muestran significativas mejoras con relacion a sus similares anteriores (24, 25) y algunos tienen caracteristicas superiores a los reactivos policlonales humanos, por ejemplo, su reactividad con hematies A2B (23).

Recientemente se describio un nuevo AcM, el BIRMA-1 anti-A, que es capaz de reconocer a las variantes Ax sin provocar el llamado fenomeno B(A), este anticuerpo fue capaz de detectar a 11 de 18 donantes con fenotipo Ax, lo que demuestra a su vez la diversidad de niveles antigenicos clasificados dentro de estas variantes Ax (23). El fenomeno B(A) es un hecho natural solo demostrable por reactivos monoclonales anti-A muy potentes (11). El reconocimiento de hematies con expresion debil del antigeno A, como los clasificados como Ax y Ael, por el AcM IHI-15 anti-A, y la ausencia de reactividad frente a hematies B tratados con papaina, que son excelentes indicadores del fenomeno B(A)(23), indica que aparentemente estamos ante un AcM de singular valor.

Segun las recomendaciones de la FDA (16), un reactivo para su evaluacion como hemoclasificador anti-A debe reconocer, en pruebas de especificidad y titulo, al menos 1 muestra de hematies A1 y 3 muestras diferentes de sangre periferica de individuos A2B, y para un hemoclasificador anti-A,B se requiere el reconocimiento de como minimo 2 muestras A1, 2 muestras A2, 4 muestras B, y al menos 3 diferentes muestras de las variantes Ax, el hemoclasificador derivado del clon IHI-15 satisface las exigencias como reactivo anti-A y podria utilizarse como parte de una mezcla de AcM para la formulacion de un reactivo anti-A,B, por su capacidad para identificar a variantes Ax.

Por otra parte, la dilucion 16 del liquido ascitico en el reactivo hemoclasificador formulado a partir del AcM IHI-15 anti- A permite que si se le realizara al producto final una serie de 6 diluciones dobles no se afecta su reactividad por la tecnica de hemaglutinacion en tubos, frente a hematies A1, y con una serie de 4 diluciones dobles, tampoco se afecta la reactividad frente a los hematies A2B, que se consideran buenos indicadores de hematies con expresion debil del antigeno A, lo que garantiza la calidad y estabilidad de este biopreparado con fines diagnosticos, segun las recomendaciones internacionales.

El AcM IHI-15 anti-A, se aplico satisfactoriamente con la formulacion y los metodos de hemaglutinacion descritos anteriormente, en un ensayo de terreno en los Bancos de Sangre Provinciales de Ciudad de La Habana, Santa Clara y Santiago de Cuba, para llegar a una cifra de mas de 800 muestras evaluadas en paralelo con reactivos hemoclasificadores basados en AcM comerciales importados y policlonales humanos de produccion nacional.

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