Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 1, 1995, pp. 30-35

ARTICULO ORIGINAL CORTO SHORT ORIGINAL PAPER

ULTRAMICROANALISIS PARA LA CUANTIFICACION DE ANTIGENO CARCINOEMBRIONARIO EN SUERO.

Alvaro Velandia^1, Gilda Nunez^2 y Rene Robaina^3

^1 Instituto Nacional de Salud, Santa Fe de Bogota, Colombia. Avenida Eldorado, carrera 50, zona 6, Apartado. aereo 80080, Santa Fe de Bogota, D.C. Colombia. ^2 Centro de Inmunologia Molecular, 216 y 15, Reparto Atabey, Ciudad de la Habana, Cuba. ^3 Centro de Inmunoensayo, Habana, Cuba. ave. 25 y 146, Reparto Cubanacan, Habana, Cuba.

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Recibido en diciembre de 1993. Aprobado en enero de 1995.

Keywords: EIA, colorectal cancer, CEA.

SUMMARY

An Ultramicroelisa (sandwich) system, using both, monoclonal and polyclonal antibodies against Carcinoembryonic antigen (CEA), was developed. The lowest detection limit of the assay is 600 pg/mL of CEA in human serum and has 3 incubation steps which can be performed in two days. Polyvinylchloride plates coated with monoclonal antibody ior-CEA1 specific against CEA are first incubated with human serum samples. Bound CEA is detected by addition of polyclonal antibodies raised in sheep labeled with beta--Galactosidase. The developed colour is proportional to the amount of CEA present in samples. Some features of the system like intra and interassay variation (5.7% and 9.4% variation coefficients respectively), dilution studies and parallelism test, system accuracy (105% recovery) are reported. An optimal correlation (r=0.9892) was found by comparison of our system with a CEA ENZELSA kit developed by CIS (CIS, Gif-Sur-Yvette, France). Also, our standard curve was compared with the standard of the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, London, England), showing very similar behaviour. Samples of normal adult population (n=14 459) presented a mean value of 3 ng/mL of CEA while 21 colon cancer samples shown a mean values of 59 ng/mL.

RESUMEN

En el presente trabajo se reporta el desarrollo de un Ultramicroelisa tipo sandwich utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra el antigeno carcinoembrionario (CEA). El limite de deteccion del ensayo es de 600 pg/mL de CEA en suero humano y tiene tres pasos de incubacion que pueden realizarse en dos dias. El anticuerpo monoclonal ior-CEA1 especifico para este antigeno se utiliza como anticuerpo de recubrimiento en placas de polivinilo, a las que se anaden posteriormente las muestras de suero humano. El CEA unido se detecta anadiendo anticuerpos policlonales anti CEA obtenidos en carnero y marcados con beta-galactosidasa. El color desarrollado es proporcional a la cantidad de CEA presente en las muestras. Se reportan algunas caracteristicas del ensayo como son variacion intra (5,7%) e interensayo (9,4%), estudios de dilucion, prueba de paralelismo y exactitud (105% de recobrado). Un coeficiente de correlacion r=0.9892 fue hallado al comparar el presente sistema con el ensayo ENZELSA para la cuantificacion de CEA de la compania CIS (Gif-Sur-Yvette, Francia). Ademas, la curva de calibracion fue comparada con el patron del Instituto Nacional de Patrones Biologicos y Control (NIBSC, Londres, Inglaterra), mostrando un comportamiento muy similar. Se ensayaron muestras provenientes de poblacion normal adulta (n=14 459) obteniendose un valor promedio de 3 ng/mL. Para el grupo de pacientes con cancer de colon y recto (n =21) el valor medio fue de 59 ng/mL.

INTRODUCCION

El CEA (antigeno carcinoembrionario) es una glicoproteina asociada a tumores del tracto gastrointestinal que fue descrita por Gold y Freedman en 1965 y cuya utilidad clinica ha sido demostrada en el manejo de los pacientes con cancer colorrectal, mamario, pulmonar y pancreatico (Lokich et al., 1978; Falkson et al., 1982; Wanebo et al., 1983). El incremento persistente de este marcador esta asociado a la presencia de la enfermedad residual o de metastasis ocultas, asi como a la progresion de la enfermedad y a la ausencia de una respuesta adecuada al tratamiento (Martin et al., 1977).

Algunos investigadores han sugerido que es posible usar los niveles sericos pre-operatorios de CEA como un marcador pronostico de la respuesta a la reseccion quirurgica del tumor (Staab et al., 1981); mientras que otros autores consideran que un incremento post-operatorio de los niveles sericos del CEA puede ser por si solo suficiente para la busqueda de metastasis ocultas remanentes (Fantini y DeCosse, 1990).

Para la cuantificacion del CEA se han desarrollado metodos de base inmunologica entre los que se incluyen el radioinmunoensayo y ensayos inmunoenzimaticos de fase solida (Carneiro et al., 1987; Lynch et al., 1988), actualmente disponibles en el mercado. El desarrollo de la tecnologia de anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ofrece la posibilidad de disponer de reactivos altamente especificos para el CEA, cuestion de fundamental importancia si tenemos en cuenta que este antigeno pertenece a una familia de moleculas que presentan entre si patrones similares de identidad inmunoquimica y reacciones cruzadas, como por ejemplo, el NCA o antigeno no especifico de reaccion cruzada, (Mach y Pusztaszeri, 1972).

En el presente trabajo se describe la normalizacion de un Ultramicroelisa (UME) para la cuantificacion de CEA en suero humano con la utilizacion del anticuerpo monoclonal (AcM) ior-CEA1 que reconoce un epitope expresado solamente en el CEA y se analizan algunas caracteristicas del sistema como la variacion intra e inter-ensayo, exactitud, estudios de dilucion y la comparacion con el ensayo comercial (ENZELSA) de la casa CIS (Gif-Sur-Yvette) y con el patron de CEA del Instituto Nacional de Patrones Biologicos y Control (NIBSC, Londres, Inglaterra; Laurence et al., 1975).

MATERIALES Y METODOS

Antigeno

El antigeno utilizado para las inmunizaciones de carneros con vistas a la obtencion de los antisueros policlonales, fue purificado por el metodo descrito por Krupey et al., en 1972, a partir de metastasis hepaticas de tumor primario de colon. El nivel de pureza fue evaluado por electroforesis en geles de poliacrilamida (Laemmli, 1970) al 7.5%, en presencia de dodecil sulfato de sodio.

Antisueros policlonales

Se obtuvieron en carnero mediante inmunizaciones con CEA purificado, segun el esquema descrito por Lamerz y Burtin en 1983. El titulo o potencia de los antisueros fue evaluado por inmunodifusion doble bidimensional (Ouchterlony y Nielsson, 1978), frente a extracto de metastasis rico en CEA.

Con el objetivo de eliminar posibles reacciones cruzadas de los antisueros con moleculas relacionadas con CEA, los mismos fueron incubados con adsorbentes preparados por polimerizacion de extractos obtenidos por homogenizacion de diferentes organos normales: colon, pulmon, bazo, higado y rinon. Los extractos fueron preparados segun una proporcion 1:3 (g/mL) del organo y agua destilada, seguido de homogenizacion en Polytron a 10 000 rpm durante 10 minutos. Despues se centrifugaron a 5 000 rpm, 10 min a 4^oC el sobrenadante fue polimerizado por adicion lenta de glutaraldehido grado I (Sigma, St. Louis, USA) para un por ciento final de 0,06, segun el metodo reportado por Avrameas y Ternynck en 1969.

El mismo metodo fue utilizado para preparar un inmunoadsorbente de suero humano, en este caso polimerizando directamente la mezcla de sueros humanos proveniente de donantes normales con glutaraldehido al porcentaje antes senalado. Al antisuero adsorbido se le probo su especificidad por inmunodifusion doble (Ouchterlony y Nielsson, 1978), frente a los extractos de organos normales y suero humano. Los anticuerpos policlonales se purificaron por cromatografia de afinidad con CEA acoplado a AH-Sefarosa segun las instrucciones del fabricante (Pharmacia-LKB, Uppsala, Suecia). Los anticuerpos anti-CEA monoespecificos purificados de esta forma se acoplaron a la enzima beta--galactosidasa (Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, CIGB, Habana, Cuba) por la tecnica del glutaraldehido en un paso (Avrameas, 1968), con el objetivo de obtener el conjugado de revelado del sistema.

Purificacion del AcM ior-CEA1

El hibridoma productor obtenido segun lo descrito por Tormo et al., en 1989, se inyecto peritonealmente en ratones Balb/c pre-inoculados con aceite mineral, y el fluido ascitico, despues de clarificado y delipidizado por ultracentrifugacion a 32 000 rpm, 4^oC durante 1 h, se purifico por cromatografia de afinidad en proteina A-Sefarosa segun recomendaciones del fabricante (Pharmacia-LKB, Uppsala, Suecia). Despues de la purificacion la fraccion recogida se dializo contra tampon salino-fosfato (PBS), 0,15 mol/L, pH 7,2 y la pureza se determino por electroforesis en geles de poliacrilamida, empleando dodecil sulfato de sodio y condiciones de no reduccion, (Laemmli, 1970).

Preparacion del patron, suero control y muestras

Una mezcla de suero humano normal enriquecido con CEA purificado, fue diluido con una cantidad apropiada de suero humano normal negativo para CEA hasta una concentracion de 100 ng/mL. La curva de calibracion tuvo cinco puntos, estos fueron: 100 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL 12.5 ng/mL y 6,25 ng/mL, obtenidos por diluciones dobles seriadas del punto de mas alta concentracion (100 ng/mL).

El control se preparo con el mismo suero utilizado para el patron, pero en este caso ajustado a una concentracion aproximada de 20 ng/mL. La solucion diluente para muestras, patron y control fue PBS 0.15 mol/L, 0,05% Tween 20 y suero de carnero al 5%. Las muestras se ensayaron a una dilucion 1:2 con solucion diluente.

Ensayo inmunoenzimatico

El ensayo se realiza por tecnicas de ultramicroanalisis (Horn et al., 1981). El UME para la cuantificacion de CEA fue disenado como un sistema ELISA tipo sandwich, con el anticuerpo monoclonal ior-CEA1 como anticuerpo de captura y anticuerpos policlonales monoespecificos unidos a la enzima beta--galactosidasa. El procedimiento basicamente consiste en lo siguiente: se adsorbe 10 uL/pozo del anticuerpo monoclonal ior-CEA1 a una concentracion de 15 ug/mL en ultramicroplacas de cloruro de polivinilo en condiciones de alcalinidad en tampon carbonato/bicarbonato 0,1 mol/L pH 9,6 a 37^oC durante 4 h en camara humeda. Despues de lavar con tampon fosfato-salino (PBS) 0.15 mol/L con 0.05% de Tween 20, (solucion de lavado); se anade 10 mL por pocillo de diluciones seriadas del patron, control y muestras diluidas 1:2 en solucion diluente y se incuban durante 18 h a 4^oC en camara humeda. Pasado este tiempo, las placas se lavan de nuevo y se incuban con el conjugado de anticuerpos policlonales monoespecificos anti-CEA /beta-galactosidasa 4 h a temperatura ambiente en camara humeda. Se lava el exceso de conjugado y se revela con 10 uL por pocillo de una solucion de 4-metilumbeliferil beta-D galactopiranosido (Koch-Light, North Mymms, Inglaterra), sustrato fluorogenico para la beta- -galactosidasa, 0,26 mg disueltos en 20 mL de tampon Tris-HCl 0,015 mol/L pH 7.8, al cual se le ha adicionado dimetil sulfoxido para una concentracion final de 5% (v/v). La reaccion se incuba durante 30 minutos a 37^oC en camara humeda y se detiene mediante la transferencia del contenido de los pocillos a las placas de lectura, con ayuda de una multipipeta automatica de 96 posiciones, evaluandose los valores de fluorescencia en un rango de 450-529 nm, con ayuda del fluorimetro SUMA.

Parametros de calidad del UME-CEA

Para evaluar las caracteristicas del sistema se analizaron los parametros siguientes:

a) Concentracion minima detectable: Se determino de acuerdo a Llano et al., en 1989.

b) Precision del sistema: La variacion intraensayo fue comprobada ensayando tres mezclas de suero humano con concentraciones que estuvieron en el rango de la curva patron, probandose seis replicas de cada mezcla en seis placas diarias. La variacion interensayo recogio la informacion de las seis placas diarias durante cinco dias.

El coeficiente de variacion (CV%) se determino para estimar la variacion estadistica de la media de las replicas, (Snedecor y Cochram, 1980).

c) Estudios de dilucion: Para la prueba de paralelismo se selecciono una mezcla de sueros normales y se anadio CEA para una concentracion de 100 ng/mL, denominandosele patron secundario. Tambien se selecciono un suero patologico con una concentracion cercana al punto maximo de la curva, denominandosele patron terciario. Se diluyen estas soluciones patrones con solucion diluente de forma seriada, midiendose sus valores de con- centracion y comparandolos con el patron primario en uso. El rango analitico de la curva dosis respuesta de cada patron fue linealizado siguiendo el metodo sugerido por Smith et al., en 1987. La linealidad fue comprobada por regresion lineal y el coeficiente de correlacion para cada linea fue calculado. El paralelismo fue comprobado por el metodo de Chi al cuadrado, descrito por Acevedo et al., en 1980.

d) Exactitud: Se analizo el recobrado, seleccionandose para ello una mezcla de sueros normales y se le determino la concentracion de CEA. A esta mezcla se anadieron seis cantidades crecientes de CEA, reevaluandose su concentracion. El recobrado fue analizado por medio de la formula: valor medido + cantidad anadida = valor teorico, entonces (valor medido / valor teorico)100 = % de recobrado).

e) Especificidad del sistema UME-CEA: Se realizo con el objetivo de verificar si el sistema reconoce la presencia de antigenos que posean reaccion cruzada con CEA en diferentes organos normales (colon, pulmon, bazo, higado, rinon). A los extractos obtenidos de la homogeneizacion de estos organos, segun lo descrito previamente, se les determino concentracion de proteinas por el metodo de Lowry (Lowry et al., 1951) y fueron ensayados en el sistema a las concentraciones siguientes: 10 ug/mL; 5 ug/mL; 1 ug/mL; 0,5 ug/mL; 0,2 ug/mL y 0,06 ug/mL.

f) Comparacion con un ensayo comercial y con un patron internacional de CEA: Se analizaron 31 muestras de suero por medio del sistema aqui descrito y el ensayo que vende la casa CIS, calculandose el coeficiente de correlacion de Pearson. Asimismo, la curva patron del sistema se comparo con el patron 2/22J del NIBSC.

Se ensayaron 14 459 muestras de suero de poblacion aparentemente normal y 21 muestras de suero de pacientes con cancer de colon por medio del sistema UME-CEA.

RESULTADOS Y DISCUSION

La purificacion del antigeno para su uso en las inmunizaciones y en la confeccion del patron, mostro una banda simple de peso molecular aparente de 180 000 Da al ser analizado por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio.

El antisuero anti-CEA obtenido en carnero despues de adsorbido con diferentes inmunoadsorbentes preparados a partir de extractos de organos normales y de suero humano normal, no mostro reactividad cruzada apreciable al ser analizado por inmunodifusion doble bidimensional.

La concentracion optima de recubrimiento del anticuerpo monoclonal anti-CEA usado en el Ultramicroelisa, fue de 15 ug/mL y la dilucion de conjugado escogida fue de 1:4 000. El rango de la curva se extiende desde 100 ng/mL a 6,25 ng/mL con un limite minimo de deteccion de 600 pg/mL (p < 0,01); esto permite trabajar con muestras patologicas sin necesidad de diluciones extremas. El coeficiente de variacion intraensayo, (tabla 1) medido para tres concentraciones diferentes y el coeficiente de variacion interensayo (tabla 2) no sobrepasaron el 10%, como se recomienda para este tipo de tecnica.

Tabla 1

Precision del sistema UME-CEA serico evaluada por medio del coeficiente de variacion intraensayo.

                     Muestras
                 -------------------
Dias              A       B      C
------------------------------------
1      
CV (%)           62,03  48,74  24,15
C (ng/mL)         5,03   4,56   4,88
2      
CV (%)           76,14  51,22  18,44
C (ng/mL)         3,52   5,16   9,54
3   
CV (%)           63,20  42,93  24,56
C (ng/mL)         6,02   4,15   8,43
4      
CV (%)           64,03  44,8   24,83
C (ng/mL)         5,45   7,02   8,68
5      
CV (%)           76,97  48,36  27,83
C (ng/mL)         4,37   3,95   5,48

C: Concentracion
CV: Coeficiente de variacion

           Concentracion de CEA en suero (ng/mL)

              A          B          C
Media      68,53      47,15      26,04
S.D.        7,38       3,83       2,75
C.V. (%)   10,20       8,10      10,10
          SD: Desviacion estandar

El promedio calculado de Chi al cuadrado para evaluar paralelismo fue de 0,098 y no se hallaron diferencias significativas entre las soluciones estandares evaluadas para un nivel de significacion del 5%.

El sistema no parece reconocer de forma apreciable moleculas relacionadas al CEA (antigenos de reaccion cruzada), al ser cuantificados extractos de diferentes organos normales; esto es consecuencia del pobre reconocimiento del monoclonal ior-CEA1 por antigenos asociados al CEA (Tormo et al., 1989) y de la especificidad lograda por las adsorciones del anticuerpo policlonal con extractos de organos normales. Se encuentran 1,2 ug/g de CEA en colon normal, lo que es congruente con reportes que describen la presencia del CEA en este organo (Egan et al., 1977). Dos de las mayores fuentes de NCA o antigeno no especifico de reaccion cruzada, como son el pulmon y el bazo (Mach y Pusztaszeri, 1972), exhibieron valores despreciables de CEA al ser analizados por el sistema; lo mismo ocurrio en el higado y el rinon.

El recobrado del sistema UME-CEA para seis concentraciones de antigeno se ubica dentro de los limites aceptados que son de un 90% a un 110%, puesto que el valor promedio del recobrado fue de 105%(tabla 3).

Tabla 3

Resultados del recobrado del sistema UME-CEA serico

           Cantidad  Valor  Valor    Porciento
           anadida   medido teorico  de recup-
           (ng/mL)  (ng/mL) (ng/mL)  eracion (%)

A           12      23,8      20      119,0
B           22      33,0      30      110,0
C           32      46,1      40      115,3
D           42      50,0      50      100,0
E           52      60,0      60      100,0
F           72      70,8      80       88,5
   

El analisis de correlacion simple de una muestra de 31 sueros evaluados por el sistema UME-CEA y el ensayo comercial de la casa CIS mostraron un coeficiente de Pearson de 0,9892, con pendiente de 0,987 e intercepto de 0,834 (figura 2), indicando con ello que las mediciones en ambos sistemas son similares. La figura 3 muestra la curva patron tipica para el sistema, y ademas las curvas obtenidas para el patron 2/22J del NIBSC y el patron de la casa comercial CIS, comprobandose que poseen un comportamiento muy similar.

La media de la concentracion de CEA de una muestra de 14 459 personas sanas evaluadas por el UME-CEA fue de 3 ng/mL, similar a las reportadas por otros autores (Go y Zamcheck, 1976), pero inferior a la media de 16 ng/mL encontrada para una muestra de poblacion cubana analizada por tecnicas de radioinmunoensayo (Fong et al., 1982). Esto pudiera ser explicado sobre la base de las diferencias atribuibles al metodo de medicion, a la fraccion antigenica o al sistema de captura utilizado (Kuroki, et al., 1983; Hedin, 1982). El valor promedio de CEA en las muestras de pacientes de cancer de colon y recto fue de 59 ng/mL y de forma general se observo un incremento del nivel del antigeno de los sueros de pacientes en etapas avanzadas de la enfermedad.

El sistema propuesto es el primer ultramicroanalisis descrito para la cuantificacion de CEA que utiliza un volumen total de reaccion de 10 ul, disenado de acuerdo con la tecnologia SUMA, automatizado, y que por sus parametros de calidad puede ser utilizado de rutina para medir CEA de forma confiable.

.1

Fig.2

Fig.3

ACEVEDO, G., J. MARTUSCELLI, J. KUMATE, M. RUIZ, R. ORTEGA, M. LIEBERMAN (1980). Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Quinta edicion. Secretaria de Salud, Mexico, p. 388.

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