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ORIGINAL SHORT PAPER / ARTICULO ORIGINAL CORTO AISLAMIENTO DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA beta-GALACTOSIDASA DE Kluyveromyces fragilis Edenia Paifer, Javier Menendez, Liliana Basabe, Vladimir Yong, Luis Rodriguez y Julio M. Delgado Division de Biotecnologia Industrial. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado 6162, La Habana 6, C.P. 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.
Code Number:BA95007 Size of Files: Text: 10.6K Graphics: Line Drawings (gif) - 35.4K Recibido en febrero de 1994. Aprobado en enero de 1995. Key words: Yeast, Kluyveromyces fragilis, beta- galactosidase, lac4. SUMMARY In this work we report on the isolation of a gene coding for beta-galactosidase from Kluyveromyces fragilis using recombinant DNA techniques and selecting the clones by complementation of the enzimatic activity of a mutant lac- E. coli. This gene was also expressed in a mutant lac- Kluyveromyces lactis. The analysis of restriction maps between genes coding for beta-galactosidase from Kluyveromyces fragilis and Kluyveromyces lactis demonstrated a great homology between them. RESUMEN En este trabajo se reporta el aislamiento del gen que codifica para la beta-galactosidasa de Kluyveromyces fragilis NRRL Y 1109 empleando las tecnicas de ADN recombinante y seleccionando los clones por complementacion de la actividad enzimatica de una cepa mutante lac- de E. coli. Este gen tambien se expreso en un mutante lac- de Kluyveromyces lactis. El analisis de los mapas de restriccion entre los genes codificantes para la beta-galactosidasa de Kluyveromyces fragilis y Kluyveromyces lactis demostro que existe una gran homologia entre ellos. INTRODUCCION La beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima que hidroliza la lactosa en sus monomeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace b 1-4 del azucar. Se conoce que la leche, por su alto contenido en lactosa,no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan beta-galactosidasa (Bayless et al., 1971). Por otra parte, en el area industrial los problemas ocasionados por la lactosa se relacionan con la utilizacion del suero de leche y con la manufactura de productos derivados de la leche (Holsinger, 1978), por lo tanto las razones del interes actual por esta enzima son basicamente nutricionales e industriales. La enzima beta-galactosidasa purificada de K. fragilis presenta mayor estabilidad ante variaciones de temperatura y de la concentracion de iones que la enzima purificada de la especie K. lactis (Mahoney y John, 1978), por lo que resultaria mas conveniente utilizar la primera para la hidrolisis de la leche y productos derivados de ella en la industria alimentaria. El objetivo de este trabajo fue aislar el gen que codifica para la beta-galactosidasa de K. fragilis como un primer paso para su posterior manipulacion con vistas a obtener un sistema que exprese eficientemente dicha enzima. MATERIALES Y METODOS Cepas y medios La cepa de E. coli MC1061 (F-, araD139, D(ara, leu)7696, DlacY74, galU, galK^+, hsr^-, hsm^+, str^+) se utilizo en todas las transformaciones bacterianas y propagaciones de plasmidios. Esta se crecio a 37^oC en medio LB y se an-adio ampicilina (LBA) a 100 ug/mL. Las cepas de levadura K. fragilis NRRL Y 1109 y K lactis SD11 (lac4-) se crecieron a 28^oC en medio YPG. Aislamiento de ADN cromosomal El ADN cromosomal de las celulas de levadura se aislo segun el procedimiento descrito por Philippsen et al. (1991).
Southern-blot Se realizo de acuerdo con la metodologia descrita por Sambrook et al. (1989).
Transformacion El metodo de transformacion utilizado para la cepa K. lactis SD11 ha sido previamente reportado (Das et al., 1984).
Construccion de la genoteca La genoteca se realizo digiriendo el ADN de K. fragilis NRRL Y 1109 con la enzima MboI. Los fragmentos de talla entre 6 y 9 kb se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusion seguido por extraccion fenolica. Estos fragmentos se ligaron al vector pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) digerido con BamHI y tratado con fosfatasa alcalina (CIP). La mezcla se transformo en la cepa MC1061 y se propago en medio LBA que contenia 5-bromo-4-cloro-3-indolilo-b-D-galactopiranosido (XGAL). RESULTADOS Y DISCUSION Aislamiento del gen lactasa de K. fragilis Despues de haber propagado 17 000 colonias de MC1061 de una genoteca de 80 000 colonias sobre medio LBA con XGAL se observo que cuatro de ellas se colorearon de azul. Estas colonias se aislaron y sus plasmidios se purificaron. Estos plasmidios se nombraron pLACKF1-4 y contenian insertos desde 7 hasta 9 kb. Debian contener el gen lactasa de K. fragilis porque las celulas de MC1061 no pueden expresar la beta-galactosidasa, pero si son capaces de expresar el gen lac4 de K. lactis cuando se transforman con el plasmidio pK16 (resultados no mostrados). El gen lactasa de K. fragilis complementa el gen lac4 de K. lactis Un fragmento XbaI-SmaI de 7.5 kb del plasmidio pLACKF1 el cual supuestamente contiene el gen lactasa de K. fragilis se subclono en el plasmidio pKRIB (Sreekrishna et al., 1984) (figura 1). El plasmidio resultante pLACE se utilizo para transformar la cepa de K. lactis SD11. Los transformantes seleccionados en medio YPG que contenia el antibiotico gentamicina (G418) a una concentracion de 100 ug/mL se replicaron sobre medio YPG con XGAL. Todos los transformantes se colorearon de azul, lo que evidencio que el gen de la lactasa de K. fragilis complementa la actividad del gen lac4 de K. Lactis. Comparacion entre los genes que codifican para la beta- galactosidasa de K. fragilis y K. lactis El gen lac4 de la levadura K. lactis fue aislado por Dickson y Markin (1978), y su secuencia nucleotidica ha sido reportada (Poch et al., 1992). Con el fin de conocer la posible existencia de homologia entre este gen y el gen que codifica para la beta-galactosidasa de K. fragilis NRRL Y 1109 se realizo un estudio de homologia a nivel de ADN entre ambas cepas. Para ello se llevaron a cabo experimentos de Southern blot con los ADN de dichas cepas, digeridos con diferentes enzimas de restriccion y empleando como sonda un fragmento ClaI-XbaI de aproximadamente 3.8 kb del plasmidio pK16 que contiene el gen lac4 de K. lactis (Dickson y Markin, 1978). La figura 2 muestra el resultado de uno de los southern blot realizados. En esta se observa que existe un patron de hibridacion similar en ambas cepas para las enzimas de restriccion empleadas, aunque en el caso en que el ADN genomico se digirio con XbaI (lineas 2 y 3) se observa una pequen-a diferencia en la talla de las sen-ales obtenidas para ambas especies. Estos resultados concuerdan con los trabajos recientemente publicados por Sor y Fukuhara (1989) acerca de la relacion entre estas especies, los cuales clasificaron estas dos levaduras dentro de una misma especie aunque mostraron evidencias de subgrupos diferentes teniendo en cuenta el taman-o y el numero de cromosomas que presentan. La figura 3 muestra el mapa de restriccion del inserto de 7,5 kb presente en el plasmidio pLACKF1 que contiene el gen lactasa de K. fragilis. Al comparar este mapa con el mapa de restriccion obtenido a partir de la secuencia del gen lac4 de K. lactis (Poch et al., 1992) puede observarse que ambos genes presentan un patron de restriccion similar. Las minimas diferencias encontradas deben ser resultado del propio metodo de confeccion del mapa de restriccion. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en los experimentos de Southern blot (figura 1), lo cual constituye otra evidencia de la posible homologia entre los genes lac de ambas especies. La secuencia del nuevo gen aislado se esta llevando a cabo. REFERENCIAS BAYLESS, T.M.; D.M. PAIGE and G.D. FERRY (1971). Lactose intolerance and milk drinking habits. Gastroenterology, 60:605-608. BREUNIG, K.D.; U. DAHLEMS; S. DAS and C.P. HOLLENBERG (1984). Analysis of a eucariotic b-Galactosidase gene: the terminal end of the yeast Kluyveromyces lactis protein shows homology to the E. coli lacZ gene product. Nucleic Acids Res. 12:2327-2341. DAS, S.; E. KELLERMANN and C.P. HOLLENBERG (1984). Transformation of Kluyveromyces fragilis. J. Bacteriol. 158:1165-1167. DICKSON, R.C. and J.S. MARKIN (1978). Molecular cloning and expression in E. coli of a yeast gene coding for b- Galactosidase. Cell 15:123-130. HOLSINGER, V.H. (1978). Applications of lactose-modified milk and whey. Food Technol. 32:35-40. MAHONEY, R.R. and R.W. JOHN (1978). Stability and enzimatic properties of b-Galactosidase from Kluyveromyces fragilis. J. Food Biochem. 1:327-350. PHILIPPSEN, P.; A. STOTZ and C. SCHERF (1991). Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods in Enzymology. Academic Press, Inc. USA. 194:169-171 POCH, O.; H. L'HOTE; V. DALLERY; F. DEBEAUX; R. FLEER and R. SODOYER (1992). Sequence of the Kluyveromyces lactis b- galactoisdase: Comparison with prokariotic enzymes and secondary structure analysis. Gene 118:55-63. SAMBROOK, J.; E.F. FRITSCH and T. MANIATIS (1989). Molecular cloning. 2nd. edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press. USA. pp. 9.31-9.62. SOR, F. and H. FUKUHARA (1989). Analysis of chromosomal DNA patterns of the genus Kluyveromyces. Yeast 5:1- 10. SREEKRISHNA, K.; T.D. WEBSTER and R.C DICKSON (1984). Gene 28:73-81. YANISCH-PERRON, C.; J. VIEIRA and J. MESSING (1985). Gene 33:103-119. Copyright 1995 Sociedad Iberolatinoamericana de Biotecnologia Aplicada a la Salud
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