Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 2, 1995, pp. 98-99

REPORTE CORTO/SHORT REPORT

Presented in the Congress Biotecnologia Habana 94. La Habana, Cuba, Nov. 28 - Dec. 3, 1994

INMOVILIZACION DE PROTEINA A DE Staphylococcus aureus EN CELULOSA MACROPOROSA ESFERICA DE PRODUCCION NACIONAL.

Gil Sh.1, I. Giraldino2, J. Delfin1, L. Davalos1, M. Chavez1, J. Diaz1, O. Quintela3 y J. M. Guisan4

1Departamento de Bioquimica, Fac. de Biologia, UH; 2EPB "Carlos J. Finlay", C. Habana, Cuba; 4Instituto de Catalisis y Petroleo- quimica, C.S.I. C. Madrid, Espana. 3UIP-Cuba 9, MINAZ.

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INTRODUCTION

El desarrollo de una industria para la obtencion de anticuerpos monoclonales (AcMs) constituye uno de los objetivos biotecnologicos priorizados en el pais. En este proceso es muy utilizada la Proteina A de Staphylococcus aureus (SpA) por su capacidad de union inespecifica a la region Fc de la mayoria de las inmunoglobulinas. Por estas razones y tomando en consideracion los resultados satisfactorios obtenidos en nuestro laboratorio, con la utilizacion de celulosa macroporosa esferica de produccion nacional en la inmovilizacion de tripsina (1) e inhibidores de proteasas (2), se decidio estudiar la inmovilizacion de SpA en este soporte. En el presente trabajo se obtienen e investigan dos preparados, Cel-SpA y celulosa- glicidol-SpA (Cel-Glic-SpA), con caracteristicas favorables que les permiten ser empleados en la purificacion de AcMs.

MATERIALES Y METODOS

La celulosa con un tamano de particula de 40 a 80 um fue oxidada con periodato de sodio y activada con glicidol (1, 3). La cromatografia de afinidad en ambas matrices se realizo a traves del procedimiento descrito por Pharmacia (4). En estos procesos se utilizo Inmunoglobulina G humana (IgGh) y liquido ascitico T3 producidos en el Instituto de Hemoderivados y los Laboratorios de CIM respectivamente. Se estudiaron la estabilidad de las matrices durante los procesos oxidativos y de inmovilizacion, asi como la pureza de las fracciones eluidas (4 y 5). Ademas, se realizo el estudio hidrodinamico de los preparados (4).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los mejores valores obtenidos de recobrado (7,8 mg IgGh/mL gel), grado de inmovilizacion (GI) (4,1 mg SpA/mL gel) y grado de oxidacion (GO) (73,9 umoles NaIO4/mL gel) para el sistema Cel-SpA resultan satisfactorios si tenemos en cuenta los antecedentes que se describen sobre este tema (5 y 6). Por otro lado, es evidente que el soporte Cel-Glic-SpA es mas eficiente al alcanzar un GO de 110,6 umoles NaIO4/mL gel, un GI de 6,3 mg SpA/mL gel y un alto valor de recobrado (16,1 mg IgGh/mL gel), lo cual corrobora nuestra hipotesis de que las limitaciones difusionales juegan un papel importante en esta cromatografia, pues la matriz que contiene el brazo espaciador muestra ventajas en estos parametros para cada una de las concentraciones de muestra adicionada en el proceso cromatografico.

Al aplicar las fracciones eluidas en el sistema SDS-PAGE se obtuvo una unica banda electroforetica, y 4 bandas en el patron de la focalizacion isoelectrica que corresponden a isoformas de la inmunoglobulina que se desea purificar. El hecho de que no se aprecie desprendimiento de SpA durante el proceso cromatografico constituye un elemento ventajoso para el empleo de este soporte en la purificacion de AcMs con fines terapeuticos.

Las capacidades dinamicas de los preparados inmovilizados resultaron satisfactorias e idoneas para el proceso de purificacion. No debemos pensar en una degradacion de los soportes durante la oxidacion e inmovilizacion, ya que las microfotografias electronicas muestran que se mantiene la estructura esferica de las particulas de celulosa, es decir, que son estables durante ambos procesos, lo cual resulta muy provechoso.

En base a nuestros resultados recomendamos el uso de la celulosa activada por el metodo de periodato de sodio o del glicidol como matrices de inmovilizacion, en sustitucion de Sefarosa-4B, con el objetivo de emplear los sistemas inmovilizados en la purificacion de AcMs de uso diagnostico y terapeutico.

REFERENCIAS

1. MART NEZ, I. et al. (1992). Biologia 6 (2)

2. DELF N, J. et al (1994). Arch. of Med. Research 25(2):199-204

3. GUIS N, J. M. (1988). Enzyme Microb. Technol. 10:375-82

4. Pharmacia (1988). Pharmacia LKB Biotechnology 48-52

5. COLEMAN, P. et al. (1990). J. of Chromatography 512:343-63

6. POIESI, C. (1989). Journal of Chromatography 465:101-11

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