Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 2, 1995, pp. 99-100

REPORTE CORTO/SHORT REPORT

Presented in the Congress Biotecnologia Habana'94. La Habana, Cuba, Nov. 28 - Dec. 3, 1994

DETECCION DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN MUESTRAS DE SANGRE COLECTADAS EN PAPEL DE FILTRO

Marleby Garcia, Rolando Ochoa, Esther Lazo, Irina Valdivia, Leticia Martinez, Janette Trujillo, Julio Ventura y Aurora Delahanty.

Centro de Inmunoensayo. Calle 234 y Ave. 25, Apdo Postal 6945, La Habana, Cuba.

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La infeccion por el Virus de la Hepatitis C (VHC), es la causa fundamental de las hepatitis NANB adquiridas por la via parenteral (1, 3). Estudios realizados demuestran que el VHC se transmite a traves de la sangre y productos sanguineos contaminados, transfusiones y contactos personales cercanos (2). La infeccion por el VHC persiste durante anos despues del episodio inicial de la hepatitis aguda, siendo la tasa de hepatitis cronica muy elevada. La cronicidad, en la mayoria de los casos, es asintomatica, pudiendo ser causa de cirrosis y cancer hepatico (2, 4). La presencia de anticuerpos al HCV, en suero, plasma o sangre de un individuo, indica que el mismo ha estado expuesto al virus, y por tanto, constituye un transmisor potencial de la enfermedad. Para detectar estos anticuerpos, hemos desarrollado un estuche diagnostico (UMELISA HCV), basado en una tecnica de los ELISA. Con el objetivo de facilitar el transporte, almacenaje y disminuir los riesgos de contaminacion del operador se han empleado las muestras de sangre colectadas en papel de filtro. En este trabajo, establecemos los parametros optimos para la elucion y la evaluacion de estas muestras.

MATERIALES Y METODOS

Muestras estudiadas

Se involucraron en este estudio un total de 361 muestras de donantes de sangre procedentes de Bancos de Sangre de La Habana y 17 muestras de pacientes asistentes a la consulta especializada en Hepatitis C del Instituto de Gastroenterologia de Cuba.

Coleccion de las muestras de sangre en papel de filtro

Se tomaron muestras de sangre de 1 cm de diametro del dedo de cada individuo, en un papel Schleicher & Schuell - 2992. La sangre debia impregnar ambas caras del papel. En el momento de la evaluacion, se realizo un ponche sobre la mancha de sangre, con un ponchador auxiliar, obteniendose discos de 5 mm de diametro. Se tomaron muestras de sangre de la vena de cada uno de los individuos, la que fue procesada hasta obtener el suero.

Se midio el volumen de sangre absorbido por un disco que fue de 3,5 uL. Este disco se eluyo en un volumen de 70 uL de solucion diluente para una dilucion final de 1:20, coincidiendo con la dilucion final de las muestras de suero. Se realizo un estudio de estabilidad con 13 muestras de sangre en papel de filtro positivas al VHC, las cuales se colocaron a 4 C y a temperatura ambiente (hasta 32 C).

Tecnicas empleadas

El UMELISA HCV es un ensayo inmunoenzimatico de tipo indirecto que utiliza como fase solida una placa de Ultramicro ELISA recubierta con peptidos sinteticos del VHC. Se emplea un conjunto anti-IgG Humana/Fosfatasa Alcalina y un sustrato fluorescente. Se emplearon ademas 3 tecnicas de referencia que fueron ORTHO ELISA HCV, UBI HCV EIA y ORTHO (RIBA) para el estudio de la poblacion de pacientes.

RESULTADOS Y DISCUSION

Se establecieron las condiciones optimas para la elucion de las muestras de sangre colectadas en papel de filtro, que debe realizarse en una hora a temperatura ambiente. El primer paso de incubacion de las muestras ya eluidas obtiene la mejor correlacion respecto a los resultados de las muestras de suero, si se realiza durante 1 hora, tambien a temperatura ambiente. En la distribucion de frecuencias para la poblacion de donantes se obtuvo un 1,38% de individuos seropostivos en suero y en sangre colectada en papel de filtro, para el 100% de coincidencia entre ambas formas de coleccion de la muestra y fueron positivos los 17 pacientes asistentes a consulta de Hepatitis C.

En los analisis de estabilidad de la IgG en el papel de filtro, hemos obtenido un 100% de recuperacion de la seropositividad para las muestras almacenadas durante 3 meses a 4 C y este valor se mantiene si se almacenan a temperatura ambiente (hasta 32 C) por un tiempo no superior a los 15 dias. Estos resultados demuestran que la utilizacion de las muestras de sangre en papel de filtro, como forma de coleccion de muestras, brinda grandes posibilidades de trabajo, debido al elevado nivel de coincidencia de sus resultados respecto a los obtenidos empleando las muestras de suero, ademas de brindar posibilidades para el almacenamiento.

REFERENCIAS

1. ALTER, H. (1990). Jour. Gastro. and Hept., 1: suppl. 78-94

2. CHOO, Q. L. et al. (1991). Brit. Med. Bull. 46:423-441

3. KWO, G. et al (1989). Science 244:362- 364

4. PADRON, G. et al. (1992). Avan. Mod. Biotechn. 1:19-25

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