Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 12, Num. 2, 1995, pp. 104-107

DETECCION DE INMUNOGLOBULINAS A Y M ESPEC FICAS PARA Toxoplasma gondii EMPLEANDO ANTICUERPOS POLICLONALES MARCADOS CON ORO COLOIDAL

Yolanda Rojas, Carlos Santizo, Martha Elena Legra y Jose Collazo.

Division de Inmunotecnologia y Diagnosticos. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado 6162, C.P.10600, La Habana 6, Cuba.

Recibido en junio de 1994. Aprobado en marzo de 1995

Key words: Toxoplasma gondii, colloidal gold, labelled polyclonal antibodies, A and M immunoglobulins

Code Number: BA95046
Size of Files:
    Text: 19K
    Graphics: Photo (jpg) 7K - / Halftone (gif) - 11K

In this article we describe the use of colloidal gold labeled polyclonal antibodies for the identification of A and M type immunoglobulins specific for Toxoplasma gondii in human serum samples. The competitive inhibition produced by immunoglobulins G was removed by the adsorption of sera with Protein A-Sepharose.

The use of colloidal gold labeled antibodies and the subsequent amplification of the reaction with silver ions, made possible the observation of the antigen-antibody reaction using the conventional optic microscope. The sensitivity and specificity of the system are 100% and 96.5% respectively.

RESUMEN

Se describe la utilizacion de anticuerpos policlonales marcados con oro coloidal para la identificacion de inmunoglobulinas de los tipos A y M especificas para Toxoplasma gondii, en muestras de suero humano. La inhibicion competitiva provocada por las inmunoglobulinas G se elimino adsorbiendo los sueros con proteina A-Sefarosa.

La utilizacion de anticuerpos marcados con oro coloidal y posterior amplificacion de la reaccion con iones de plata, posibilito la observacion de la reaccion antigeno-anticuerpo al microscopio optico convencional. La sensibilidad y la especificidad del metodo son 100% y 96,5%, respectivamente.

INTRODUCCION

La interpretacion de los metodos serologicos empleados para el diagnostico temprano de la infeccion aguda con Toxoplasma gondii es complicada, por la prevalencia de altos titulos de IgG contra toxoplasma en individuos normales de la poblacion (1) y el hecho de que los anticuerpos de tipo IgM persisten en algunos individuos durante meses o anos despues de la infeccion aguda (2). La presencia de IgA contra toxoplasma ha sido reportada por algunos investigadores, empleandose para su deteccion diferentes metodos; muchos han considerado que estos anticuerpos son importantes para el diagnostico del estado agudo de la infeccion (2, 3, 4). El metodo mas empleado es la inmunofluorescencia indirecta (IFI), en la cual se han observado resultados falsos negativos a causa de la inhibicion competitiva provocada por los anticuerpos de tipo IgG especificos (5, 6, 7). Para eliminar estos anticuerpos se han utilizado diferentes metodologias como son la centrifugacion con gradiente de sacarosa (8), cromatografia de exclusion molecular (6), adsorcion con inmunoglobulinas insolubilizadas (9), proteina A (10) o anticuerpos contra la porcion Fc de las gammaglobulinas (11).

Una gran cantidad de ligandos, como inmunoglobulinas, lectinas, toxinas y proteina A fueron empleados en la formacion de complejos con oro coloidal, para la identificacion de determinadas moleculas (12).

En el presente trabajo nosotros utilizamos una metodologia simple para la deteccion del complejo antigeno anticuerpo, que consiste en la utilizacion de anticuerpos policlonales especificos (anti-IgA e IgM) marcados con oro coloidal y un segundo paso de amplificacion de la senal con iones de plata, lo que permite su visualizacion al microscopio optico convencional.

MATERIALES Y METODOS

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos policlonales [1 mg/mL en tampon fosfato salino (PBS)], producidos en carnero, especificos para las inmunoglobulinas A y M humanas, donados por el Centro de Inmunoensayo de Ciudad de La Habana. Se dializaron durante 12 h contra una solucion de cloruro de sodio 5 mM a 4 C.

Conjugado

El coloide de oro monodisperso de 15 nm de diametro se obtuvo por reduccion controlada de una solucion de acido tetracloroaurico (MERCK), empleando citrato trisodico (MERCK) 1% en agua destilada como agente reductor(13). El pH del coloide se ajusto al valor optimo para el acoplamiento, con carbonato de potasio (MERCK) 0,2 M, este valor se determino segun el test de floculacion reportado por Roth (14).

El acoplamiento de las inmunoglobulinas al oro y su posterior purificacion, se realizo acorde con el procedimiento descrito por Roth (14). Despues de purificado, el precipitado (anticuerpos marcados con oro coloidal) se reconstituyo en tampon fosfato 0,1 M pH 7,2-7,4 con BSA (Albumina Bovina) al 1% y se almaceno a 4 C.

Antigeno

Los trofozoitos de Toxoplasma gondii se obtuvieron por inoculacion de la cepa RH en ratones Balb/c. Se inocularon 1.5 x 10^6 celulas en la cavidad abdominal de cada raton; despues de tres dias se les extrajo el liquido ascitico, el cual se sometio a lavados continuos con PBS a 400 g durante 10 min, posteriormente se fijaron con formaldehido al 0,5%, se lavaron nuevamente y se ajusto la concentracion a 3,5 x 10^6 celulas/mL de PBS, BSA al 0,1%.

En cada pocillo de la lamina portaobjetos se deposito una gota de aproximadamente 10 uL de la solucion que contiene los trozofoitos de Toxoplasma gondii, se secaron a temperatura ambiente y se guardaron a 4 C.

Muestras

El Centro de Higiene y Epidemiologia de Ciudad de la Habana dono las muestras positivas a las que se les determino por IFI la presencia de anticuerpos de los tipos A, G y M.

La muestra se considero positiva para IgG si se observaba senal en la dilucion de 1/32 y para IgA y M en la dilucion de 1/8. Las muestras negativas provienen de donantes de banco de sangre serologicamente negativos o con titulos de anticuerpos menores de 1/32, determinado por IFI.

Eliminacion de las IgG del suero

Para eliminar las IgG del suero se utilizo Proteina A acoplada a Sefarosa CL-4B (Pharmacia LKB) como immunoadsorbente. Las muestras a analizar se diluyeron 1/5 con el inmunoadsorvente (80 uL de inmunoadsorbente con 20 uL de suero) y se mantuvieron en agitacion durante 1 h a temperatura ambiente.

Despues de otra hora en reposo se hicieron diluciones dobles seriadas del sobrenadante en tampon fosfato 0,1 M pH 7,2-7,4, a partir de 1/8. La eliminacion de las IgG del suero se realizo tanto para la IFI como para la deteccion con oro-plata.

IFI

La IFI se utilizo como metodo de referencia. Los sueros, despues de ser adsorvidos con proteina A-Sefarosa CL-4B, se pusieron a reaccionar durante 30 min a 37 C, en camara humeda, sobre las laminas sensibilizadas. Pasado el tiempo de reaccion se lavaron con PBS y se incubaron con los conjugados especificos diluidos con azul de Evans, durante 30 min en camara humeda a 37 C. Despues de lavadas nuevamente con PBS, se secaron y se observaron en el microscopio de fluorescencia con aumento de 40X.

Controles

-Control positivo (IgM)

Suero serologicamente positivo para Toxoplasma gondii, con un titulo (IgM) de 1/64.

-Control positivo (IgA)

Suero serologicamente positivo para Toxoplasma gondii, con un titulo (IgA) de 1/32.

-Controles negativos

Sueros no reactivos para Toxoplasma gondii. Los titulos de los controles se determinaron por IFI. El sistema comercial AuBiodot-tox G se empleo para determinar el titulo de IgG antes y despues de la adsorcion con proteina A-Sefarosa.

El procedimiento a seguir en cada caso fue el siguiente: se depositaron 10 uL de los sueros problemas sobre cada circulo de las laminas portaobjetos y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente, se lavaron con tampon fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2-7,4 durante 10 min y se incubaron con los conjugados especificos durante 30 min. Transcurrido el tiempo de reaccion se lavaron nuevamente y se incubaron con el revelador fisico (amplificador de plata JANSSEN), a temperatura ambiente en camara humeda, durante 10-15 min. Finalmente se lavaron las laminas por inmersion en agua destilada durante 1-2 min y se secaron para su observacion directa al microscopio optico convencional BH-2 (100X, inmersion con glicerol).

Procesamiento estadistico

Los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo se calculo de acuerdo con un reporte de la Organizacion Mundial de la Salud (15).

RESULTADOS Y DISCUSION

El acoplamiento al oro coloidal de los anticuerpos policlonales anti IgM e IgA se hizo a pH 7,0-7,2 y 8,0-8,2 respectivamente y se mantuvo estable durante siete meses a 4 C. Este proceso de acoplamiento depende de muchos factores para su estabilidad, como son: la concentracion, conformacion y punto isoelectrico de la proteina, asi como de la fuerza ionica, pH y temperatura del medio de suspension (13, 16, 17, 18). Para este caso (anticuerpos policlonales) donde existe una mezcla de proteinas con diferentes puntos isoelectricos, fue posible seleccionar el valor de pH optimo para el acoplamiento, a traves del test de floculacion (14). Este fue el valor de pH en el que el coloide mantuvo su estabilidad frente a la accion de las sales con una menor cantidad de proteinas.

Fig.1 Fotografia con microscopio optico de la reaccion de una muestra positiva.

La figura 1 muestra como se visualizan los toxoplasmas al microscopio optico, despues de la reaccion con una muestra positiva y el correspondiente marcaje con oro-plata; en el caso de muestras negativas, no es posible observarlos al microscopio optico.

La tabla 1 muestra los resultados obtenidos utilizando anticuerpos conjugados a oro-plata; en ella se observa la reduccion de los titulos despues de la adsorcion de los sueros con proteina A Sefarosa CL-4B. Como ha sido reportado por diferentes autores (5-11), los sistemas empleados en la deteccion de IgA e IgM dan resultados falsos negativos debido a una inhibicion competitiva de los anticuerpos especificos al Toxoplasma gondii.

La capacidad de union de la proteina A-Sepharosa CL-4B empleada para la inmunoadsorcion es de aproximadamente 20 mg de IgG/mL de gel. Nosotros utilizamos 80 uL de gel que debe tener una capacidad de union de 1,6 mg; la cantidad de IgG/mL de suero en humanos es aproximadamente 13 mg (19), observandose en los resultados obtenidos la disminucion de los titulos de IgG y por tanto la reduccion de su interferencia en la deteccion de titulos bajos de IgA e IgM (1/8).

Tabla 1. Resultados de la deteccion de los titulos de Igs A, G y M

-----------------------------------------------------------------
Referencia    IgG*S/A      *A      IgM      IgA
clinica
-----------------------------------------------------------------
Embarazadas     1/32        -       -        1/16
                1/32        -       1/8      -
                1/256       -       1/32     1/16
Abortos         1/32        -       1/16     -
                1/256       -       1/16     1/16
Trastornos      1/32        -       1/8      1/8
oculares        1/32        -       1/8      1/8
                1/128       -       -        1/16
                1/128       -       1/8      1/64
                1,256       -       1/16     -
Otras           1/32        -       -        -
causas          1/64        -       -        1/16
                1,256       -       1/16     -
                1/512       1/16    1/64     1/64
                1/1024      1/16    -        1/16
Donantes       *1/32        -       -        -
                1/16        -       -        -
                27 sueros   -       -        -
-------------------------------------------------------------

La deteccion de las Igs A y M es de gran importancia para el diagnostico temprano de la infeccion en mujeres embarazadas, diagnostico prenatal y de los recien nacidos en los que existan razones para sospechar de una infeccion congenita, por lo que titulos de estos anticuerpos pueden tener valor diagnostico si se tiene en cuenta que estos anticuerpos son los primeros que aparecen despues de una infeccion reciente. Muchos procedimientos han sido empleados para la deteccion de estas inmunoglobulinas entre los que se encuentra la IFI. Con la metodologia empleada por nosotros obtuvimos resultados similares a los observados con la IFI para los sueros positivos. A estos sueros no se les determino por IFI el titulo final para cada una de las inmunoglobulinas, pero si hubo correspondencia en la presencia o no de estos anticuerpos en un titulo que puede tener valor diagnostico (1/8) (1, 3, 4).

En el caso de las muestras negativas estudiadas encontramos un suero con un titulo de 1/32 que es negativo por IFI. Para este suero no encontramos titulos de IgA e IgM, por lo que las IgG circulantes pueden deberse a una vieja adquisicion de la infeccion.

El metodo empleado por nosotros tiene una buena sensibilidad (100%) y especificidad (96,5%) respecto al procedimiento convencional de IFI. La probabilidad de que un suero tenga anticuerpos especificos al Toxoplasma gondii cuando la prueba da positiva es de 93,75%. Esto, unido a la ventaja que ofrece la posibilidad de observacion de los resultados al microscopio optico convencional, hace pensar en la utilizacion de esta metodologia para la deteccion de IgA e IgM especificas para el Toxoplasma gondii.

REFERENCIAS

1. REMINGTON, J. S. and G.Y. DESMONTS (1990). Infectious diseases of the fetus and newborn infant. In: Toxoplasmosis. J.S. Remington, J.O. Klein, Ed. Philadelphia: Saunders., 89-195.

2. PINON, J. M.; H. THOANNES and N. GRUSON (1985). An enzyme-linked immuno-filtration assay used to compare infant and maternal antibody profiles in toxoplasmosis. J. Immunol Methods 77:15-23.

3. PARTANEN, P.; L. TURUNEN and R.A. PAASIVUO (1984). Immunoblot analysis of Toxoplasma gondii antigens by human immunoglobulins G, M, and antibodies at different stages of infection. J. Clin. Microbiol. 20: 133-135.

4. STEPICK-BIEK, P. P.; F. G. THULLIEZ and J.S. REMINGTON (1990). IgA antibodies for diagnosis of acute congenital and acquired toxoplasmosis. The J. Infect. Dis. 162: 270-273.

5. VAN LOON, A. M.; J. T. VAN DER LOGT.; F. W. HEESSEN and J. VAN DER VEEN (1983). Enzyme-linked immunoadsorbent assay that uses labeled antigen for detection of immunoglobulin M and A antibodies in toxoplasmosis: comparison with indirect immunofluorescence and double-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. J. of Clin. Microbiol. 17:997-1004.

6. FILLICE, G. A.; A. S. YEAGER and J. S. REMINGTON (1980). Diagnostic significance of immunoglobulin M antibodies to Toxoplasma gondii detected after separation of immunoglobulin M from immunoglobulin G antibodies. J. Clin. Microbiol. 12:336-342.

7. PYNDIAH, N.; U. KRECH, P. PRICE and J.WILHELM (1979). Simplified chromatographic separation of immunoglobulin M from G and its application to toxoplasma indirect immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 9:170-174.

8. VESIKARI, T. and A. VAHERI (1968). Rubella: a method for rapid diagnosis of a recent infection by demostration of the IgM antibodies. Br. Med. J. i:221-223.

9. HYDE, E.; V. BARNETT and J.S. REMINGTON (1975) Method for differentiation of non-specific toxoplasma IgM fluorescent antibodies in patients with rheumatoid factor. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148:1184-1188.

10.CHANTLER, S.; E. DEVRIES; P. R. ALLEN and A. L. HUEN (1976). A rapid immunofluorescent procedure for the detection of specific IgG and IgM antibody in sera using Staphylococcus aureus and latex-IgG as adsorbents. J. Immunol. Methods 13:367-380.

11 HEKKER, A. C.; B. BRAND-SAATHOF; J. VIS and R.C. MEYERS (1979) Indirect immunofluorescence test for detection of IgM antibodies to cytomegalovirus. J. Infect. Dis. 140:596-600.

12.FALCON, V.; N. BARANOSKY; F. O. CASTRO; C. MONTERO; M. GONZALEZ; O. HAYES; O. A. BIENVENIDO and S. MANDADOS (1993). Ultraestrutural and immunocytochemical characteristics of hepatocytes from hepatitis B virus infected chimpanzees. Tissue and Cell 25:6.

13.FRENS, G. (1973). Controlled nucleation for the regulation of particle size in monodisperse gold suspension. Nature Phys. Science 241:20-22.

14.ROTH, J. (1983). The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry. In: Techniques in immunocytochemistry. Eds. G.R. Bullock, and P. Petrusz. Academic Press, London., 2:217-284.

15.WORLD HEALTH ORGANIZATION (1994). Operational characteristics of commercially available assays to detect antibodies to HIV-1 and/or HIV-2 in human sera. Global programme on AIDS Report 8. Geneva.

16.HORISBERGER, M.; J. ROSSET and H. BAUER (1975). Colloidal gold granules as markers for cell surface receptors in scanning electron microscopy. Experientia 31:1147-1149.

17.DE MEIJ, J. R. (1983). Colloidal gold probes in immunocytochemistry. In: Immunochemistry; Practical applications in pathology and biology. Eds Polack, J. M and Van Noorden, S. John Wright and Sona, Bristol-London-Boston. 82-112.

18.GEOGHEGAN, W. D. and G. A. ACKERMAN (1977). Adsorption of horse radish peroxidase, ovomucoid and anti-immunoglobulin to colloidal for the indirect detection of concanavalin A, wheat germ aglutinon and goat anti-human immunoglobulin G on cell surfaces at the electron microscopic level: A new method theory and application. J. Histochem. Cytochem. 11:1187-1200.

19.CHARLES, A.H. and J.D. CAPES (1989). Immunoglobulins: Structure and function. In: Fundamental Immunology. Eds. Williame Paul, M.D. Raven Press, New York. 2:209-234.

Copyright 1995, Sociedad Iberolatinoamericana de Biotecnologia Aplicada a la Salud La Habana, Cuba

The following images related to this document are available:

Halftone images

Photo images