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INFLUENCIA DEL USO DE ADITIVOS EN LA LIOFILIZACION DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE RECOMBINANTE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B Viv ian Pujol, Jorge Sotolongo, Maribel Vega, Judith Pineda y Lourdes Costa Departamento de Desarrollo Biofarmac eutico, Centro de Ingenier ia Genetica y Biotecnologia, Apartado 6162, La Habana, Cuba. Recibido en agosto de 1994. Aprobado en septiembre de 1995 Code Number:BA96003
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Graphics: Line Drawings (gif) - 19.5KABSTRACT Yeast derived recombinant HBsAg is lyophilized as a preservation method for long term storage. Three different lyophilization cycles were assayed. The freezing temperature was -50 C, the rate of ice sublimation was 10 C/h and also sublimation at 10 C and 20 C was tested with temperature for desorption of residual water of 25 C and 30 C respectively. Additives like dextran, maltose, sucrose, magnesium chloride and trehalose were studied in the lyophilization and for all of them, the HBsAg activity recovery after lyophilization was about 100%. Residual humidity of lyophilized samples was of 2% in all the cases. The structure of assembled particles of HBsAg was not affected by lyophilization pr Cess using sucrose and maltose as additives. Key words: recombinant HBsAg, preservation method, lyophilization, aditives RESUMEN El antigeno de superficie del virus de la hepatitis B es liofilizado como m etodo de conservaci on. Se estudiaron tres ciclos de liofilizaci on, la temperatura de congelacion fue -50 C en todos los casos; se estudi o un esquema lento de sublimaci on del hielo a raz on de 10 C/h, se ensay o la sublimaci on a -10 C y 20 C; las temperaturas de desorci on del agua residual fueron 25 C y 30 C respectivamente. Se realiz o un estudio de liofilizaci on empleando aditivos como dextrana, maltosa, sacarosa, cloruro de magnesio y trehalosa; los valores de actividad del liofilizado no mostraron diferencias respecto a los valores iniciales; el porcentaje de humedad residual de los liofilizados fue menor del 2%; se obtuvo una correcta particulaci on del antigeno determinado por cromatograf ia de esclusion molecular por HPLC al emplear bajas concentraciones de sacarosa y maltosa. Palabras claves: AgsHB recombinante, metodos de preservacion, liofilizacion, aditivos. Introduccion La hepatitis viral del tipo B presenta actualmente uno de los mayores indices de incidencia mundial dentro de las enfermedades infecciosas, de ah i la importancia de obtener el antigeno de superficie del virus (AgsHBr) puro para ser empleado confines terap euticos. El AgsHB es una prote ina perfectamente caracterizada que se encuentra en la superficie del virus formando particulas de aproximadamente 100 subunidades de mon omero de peso molecular de 24 KDa por lo que queda estabilizada la estructura por enlaces disulfuro (1). El AgsHBr se obtiene mediante tecnicas del ADN recombinante de un cultivo de levaduras. La liofilizaci on es muy usada en la produccion de proteinas que son inestables para su distribucion y uso en soluciones acuosas. La solucion acuosa con la prote ina se congela, el agua congelada se extrae por sublimacion a baja presi on durante el secado primario, y la no congelada contenida en la sustancia intersticial se elimina durante el secado secundario (2). Algunos componentes qu imicos o excipientes son adicionados a la formulaci on con un proposito definido: como lioprotectores para aumentar la estabilidad durante el proceso de liofilizacion, como excipiente para aumentar la estabilidad del producto seco o como sustancia de carga para darle mejor presentacion (elegancia) al producto (3, 4). Una amplia variedad de aditivos, incluyendo azucares, polioles, metilaminas y algunas sales son efectivas para minimizar la desnaturalizaci on de las proteinas en las fases de estres (altas y bajas temperaturas) (5, 6, 7). El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la formulacion y el comportamiento de la part icula AgsHBr en el proceso de liofilizaci on para un posterior estudio de estabilidad del antigeno liofilizado. Materiales y M etodos Pr Cedencia del ant igeno (AgsHBr) Se utiliz o AgsHBr obtenido mediante clonaje y expresion del genen Pichia pastoris (8); la muestra pr Cedente de la fermentacion de la cepa productora se extrajo mediante ruptura celular y fue purificada hasta los niveles requeridos para ser adyuvada como preparado vacunal. Preparaci on de las muestras Las muestras que conten ian AgsHBr se filtraron de manera est eril a traves de filtros 0,2 micras (Millipore) y se dispensaron en bulbos 2R norma DIN en un volumen de 1 mL. Para el llenado de los bulbos se emple o una maquina llenadora semiautomatica (Paxall, USA). Cuando la liofilizaci on se realiz o con aditivos, se anadio en todos los bulbos 300 microg/mL de antigeno. Las muestras empleadas se conservaron antes y despu es de la liofilizaci on a una temperatura de 4 C. Reactivos empleados Los reactivos empleados fueron: sacarosa, maltosa, cloruro de magnesio, trehalosa y dextrana (Merck, Alemania). Liofilizacion Se empleo una liofilizadora (Edward Kniese, Inglaterra) modelo S08 con una capacidad de evacuacion de hielo de 20 kg. La camara se llen o con aproximadamente 800 bulbos, de estos solo 6070 contenian AgsHBr; el resto contenia agua en un volumen de 1 mL. Se registr o de forma continua la temperatura de los productos y la conductancia de la soluci on; todos los ciclos experimentales se dieron por concluidos cuando las temperaturas de los productos y de las platinas se igualaron por espacio de al menos 4 h; se realizo la prueba de control de vacio en la camara (variaci on menor de 0,5 microbar cada 1 h) hasta finalizar el proceso. La presi on en la camara se mantuvo en la fase de sublimacion entre 90110 microbar y durante la desorci on en 10 microbar. La temperatura del condensador fue de 70 C Humedad residual En cada experimento 12 bulbos de diferentes l Calizaciones de la camara fueron seleccionados para determinar el contenido de agua residual. El porcentaje de humedad residual se determino por el m etodo de Karl Fisher (9), empleandose un sistema de titulaci on DTS830 (Radiometer, Dinamarca). Determinaci on de AgsHBr Se determino el contenido de AgsHBr de las muestras antes y despues de liofilizadas empleando un sistema ELISA con anticuerpos policlonales (10). Los valores de concentracion reportados son el promedio de tres determinaciones realizadas a cada muestra. La variabilidad del metodo fue en todos los casos menor del 5 %. Particulaci on del antigeno. Cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) La talla molecular del antigeno antes y despues de liofilizado se analiz o mediante cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC), empleando una columna TSK5 000 de gel filtracion (11). Apariencia y reconstituci on La apariencia del producto liofilizado y el tiempo de reconstituci on fueron rigurosamente observados en cada ensayo, teniendo en consideracion el aditivo empleado. Los bulbos liofilizados se reconstituyen con 1 mL de agua para inyecci on; la reconstituci on se realiz o a temperatura ambiente y con una ligera agitaci on manual. Resultados y Discusi on Inicialmente se exploro el efecto de 3 ciclos de liofilizacion con las condiciones de sublimacion y desorci on diferentes para el AgsHBr sin el empleo de ningun aditivo; se ensayaron esquemas lentos y rapidos de sublimacion del hielo, as i como dos temperaturas de sublimacion y desorci on del agua residual respectivamente. En la tabla 1 se muestran las condiciones de liofilizacion ensayadas en los tres ciclos iniciales de liofilizacion estudiados sin anadir ningun aditivo al AgsHBr. En el tercer ciclo propuesto se emple o un esquema lento de sublimacion, incrementandose la temperatura de las platinas a raz on de 10 C/hora. Tabla 1. Ciclos de liofilizaci on ensayados para el AgsHB-r (sin el empleo de aditivos)
Parametros Ciclos de
Liofilizaci on
-------------------------------------------------
I II III
Temp. congelaci on (C) -50 -50 -50
Tiempo de congelaci on (h) 2 2 2
Temp. sublimaci on (C) 20 20 -10
Tiempo de sublimacion (h) 2 2.5 11
Temp. de desorci on (C) 30 30 25
Tiempo de desorci on (h) 5 10 4.5
Las temperaturas reportadas estan referidas a los valores
de temperaturas de las platinas. Al liofilizar el AgsHBr sin el empleo de ningun aditivo no se obtuvo una variaci on significativa de la actividad biologica de las muestras por efecto de la liofilizacion (variaciones menores del 5 % al emplear un sistema ELISA con anticuerpos policlonales). El porcentaje de humedad residual obtenido es el adecuado para este tipo de producto liofilizado (Tabla 2). Al realizar una cromatograf ia de gel filtraci on por HPLC del ant igeno liofilizado se observo la presencia de un pico de mayor talla molecular. Los cromatogramas correspondientes se muestran en la Figura 1 a, b, c. De los 3 ciclos estudiados los mejores resultados de porcentaje de humedad residual y menor grado de sobreparticulacion del ant igeno correspondieron al ciclo III. Se decidio realizar un estudio de estas condiciones de liofilizaci on con el empleo de diferentes aditivos para tratar de disminuir el efecto de sobreparticulaci on del antigeno. Los reactivos estudiados y sus concentraciones son seleccionados de acuerdo a lo reportado (2). Tabla 2. Resultados de concentraci on de AgsHB-r por ELISA y porcentaje de humedad residual del ant igeno para los tres ciclos propuestos al liofilizar sin el empleo de aditivos
Concentracion de AgsHB-r Ciclos de
liofilizacion
----------------------
(microg/mL) I II III
--------------------------------------------------
Sin liofilizar 360.5 421.3 284.2
Liofilizado 442.8 322.9 289.0
% de humedad residual 2.21 1.8 1.5
Por tal raz on para las experiencias de liofilizaci on con aditivos se emple o las condiciones del ciclo III. Los resultados de actividad del ant igeno antes de liofilizar y liofilizado empleando aditivos en cada concentraci on estudiada son reportados en la tabla 3. Es necesario señalar que en ningun caso se produce una disminuci on significativa de la actividad despu es de ser liofilizada la muestra. La tabla 4 muestra que al liofilizar empleando los parametros de la variante experimental sin aditivos, se obtiene un 95,8 % de antigeno presente en forma de particula, reportandose mayores porcentajes de ant igeno sobreparticulado (mayor de 22 nm) al liofilizar con las variantes I y II. Ademas al emplear la variante I se obtiene un 11,5 % de antigeno desparticulado. En la Figura 2 se exponen los parametros fundamentales del ciclo de liofilizaci on empleados en la variante experimental III.
a)Ciclo de liofilizaci onI. b)Ciclo de liofilizaci onII. c)Ciclo de liofilizaci onIII. d)Ciclo de liofilizaci onIII empleando sacarosa al 2% como aditivo. Figura 2. Parametros fundamentales de la variante experimental III. Al analizar el grado de sobreparticulaci on del ant igeno se observ o que al adicionar dextrana y cloruro de magnesio se obten ian altos porcentajes de ant igeno sobreparticulado (Tabla 4). De todos los aditivos empleados, los mejores resultados de particulaci on del ant igeno se obtuvieron al utilizar sacarosa en cualquiera de las concentraciones anadidas. Tambi en se obtuvieron resultados satisfactorios al adicionar maltosa en la concentraci on mas baja (2 %). La sacarosa puede ser facilmente eliminada de la formulaci on por un simple pr Ceso de diafiltraci on, obteniendo altos porcentajes de recobrado en este paso y es ademas un reactivo mas barato que la maltosa. Pudiera emplearse sacarosa en cualquiera de las concentraciones estudiadas por los resultados de calidad obtenidos para la mol ecula, pero se propone emplear 2 % por ser la concentraci on mas baja estudiada con resultados satisfactorios y por lo tanto mas facilmente eliminada por diafiltraci on. Tabla 3. Aditivos empleados al liofilizar el ant igeno. Concentraciones ensayadas y resultados de actividad biologica para cada concentracion de aditivo empleada
Aditivos Concentracion Concentracion de
(mg/mL) AgsHB-r.
(microg/mL)
---------------------------------------------------------
Sin liofilizar - 282,3
Sacarosa 2 315,7
5 206,7
10 368,6
20 287,7
30 210,7
40 208,0
Maltosa 2 286,3
5 279,4
10 291,78
20 212,7
30 297,0
40 244,0
Dextrana 10 241,2
20 203,8
30 202,3
40 196,4
Cloruro de magnesio 2 232,1
5 217,4
10 223,4
20 274,6
Trehalosa 5 300,0
10 240,0
En la Figura (1d) se muestra el cromatograma de las corridas de HPLC correspondientes al ant igeno liofilizado en presencia de sacarosa, con la menor concentracion estudiada. Como se observa se obtiene el AgsHBr consutalla molecular caracteristica, no presentandose ant igeno sobreparticulado. Tabla 4. Granado de particulacion del antigeno obtenido en los diferentes ciclos experimentados con o sin el empleo de aditivos
Ciclio Aditivo Concentracion %Antigeno %Antigeno %Antigeno
(mg/mL) sobre- formando despartic-
particulado particulas ulado
de 22 nm
--------------------------------------------------------------
I - - 16.6 71.9 11.5
II - - 29.0 71.0 -
III - - 4.2 95.8 -
--------------------------------------------------------------
III Sacarosa 2 - 100.0 -
5 - 100.0 -
10 2.1 97.9 -
20 3.7 96.3 -
30 - 100.0 -
40 0.4 99.6 -
---------------------------------------------------------------
III Maltosa 2 0.3 99.7 -
40 1.3 98.7 -
---------------------------------------------------------------
III Dextrana 10 11.8 88.2 -
40 3.9 96.1 -
---------------------------------------------------------------
III Cloruro de 2 7.5 92.5 -
magnesio 20 8.2 91.8 -
---------------------------------------------------------------
III Trehalosa 5 3.0 97.0 -
20 1.4 98.6 -
---------------------------------------------------------------
Apariencia del producto liofilizado y tiempo de reconstitucion Los bulbos que solo contenian antigeno, sin ningun aditivo, al ser liofilizados mostraron una pequea pastilla sin grandes deformaciones estructurales. Al liofilizar con sacarosa se obtuvo una pastilla consumida. Los liofilizados con maltosa y cloruro de magnesio presentaron la formaci on de escama superficial con hundimiento de estructura. En los bulbos que contenian dextrana como preservante se obtuvo una pastilla blanca, homogenea y sin deformaciones en su estructura. Todos los bulbos fueron facilmente reconstituidos en 1 mL de agua para inyecci on, lograndose disolver con rapidez la pastilla hasta lograr una soluci on totalmente transparente y homogenea. Conclusiones No se observan cambios significativos en la concentraci on por ELISA del ant igeno de superficie recombinante del virus de la hepatitits B al ser liofilizada con o sin la presencia de aditivos. Al liofilizar AgsHBr sin el empleo de aditivos se obtiene una sobreparticulaci on del antigeno en las tres variantes de ciclos propuestos. Al liofilizar con los parametros de la variante experimental III y adicionando sacarosa como aditivo en concentraciones de 2, 5, 10, 20, 30 y 40 mg/mL se obtuvo una correcta particulacion del ant igeno. Se propone emplear la concentraci on mas baja de sacarosa estudiada (2 mg/mL). Si se anade maltosa como estabilizante tambi en se logra disminuir la sobreparticulaci on del ant igeno.
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