Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 1, 1996

PCR en el diagnostico veterinario de micoplasmas

Y, R. Chavez,^1 C. Fernandez^1 y K. E. Johansson^2

^1 Dpto. de Biologia Molecular, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apto.10, San Jose de las Lajas, La Habana, Cuba. ^2 The National Veterinary Institute, Box 7073, S-750 07 Uppsala, Sweden

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Introduccion

Los micoplasmas son microorganismos sin pared celular que tienen gran afinidad por celulas eucariotas llegandoles a causar serias afectaciones (1). En animales importantes enfermedades son producidas por micoplasmas y estos son tambien una de las mayores causas de contaminacion y perdida en cultivos celulares (2, 3). Para la deteccion de micoplasmas se han desarrollado metodos bacteriologicos, serologicos, bioquimicos, de hibridacion de acidos nucleicos y mas recientemente la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

En este trabajo se desarrollo la tecnica de PCR basada en la amplificacion del gen del RNA-ribosomal 16S para la deteccion de micoplasmas de interes veterinario y en cultivos celulares.

Materiales y Metodos

Se utilizaron cepas de referencia, muestras clinicas directas y de cultivo de celulas. Para cultivo de celulas los cebadores fueron tomados de la literatura (4,5) y para los de interes veterinario fueron disenados por nosotros. Las muestras fueron procesadas y 5 uL fueron utilizados en una mezcla de reaccion final de 50 uL. Las reacciones se realizaron en un equipo REACTOR THERMAL HYBAID. El estudio del producto amplificado se realizo en geles de agarosa tenidos con bromuro de etidio. Se realizaron estudios de sensibilidad y especificidad en cada caso.

Resultados y Discusion

Los dos juegos de primers utilizados en cultivo de celulas amplificaron un fragmento de 715 y 1 500 pb respectivamente y detectaron hasta 2 x 104 ufc/mL lo cual es un grado de sensibilidad adecuado para la deteccion. De 47 muestras evaluadas 40 de ellas fueron positivas y 7 negativas coincidiendo estos resultados con los obtenidos por cultivo microbiologico y por hibridacion de acidos nucleicos. De los micoplasmas de interes veterinario fueron seleccionados Mycoplasma bovis (Mb) y Mycoplasma qallisepticum (Mg). Los primers utilizados para la deteccion de Mb y Mg amplificaron un fragmento de 360 y 530 pb respectivamente. La sensibilidad obtenida para Mb fue de 4 x 102 ufc/mL y para Mg de 8 x 102 ufc/mL.

En los dos sistemas los primers fueron especificos para la especie de interes a detectar no amplificando otros micoplasmas bovinos o aviares en cada caso. El sistema de PCR para Mb fue evaluado en 40 muestras de exudados nasales de terneros de las cuales 18 fueron positivas coincidiendo con los resultados obtenidos por cultivo microbiologico. Estos resultados avalan el uso del PCR en el diagnostico de este genero microbiano.

1. Tully JG. Enciclopedia de Microbiologia 1992;3:181-191.
2. Razin S et al. En The Mycoplasmas 1985;4:508.
3. Bolske G. Zentralblatt fur Bakteriologie und Hygiene        
   1988;A269:331-340.
4. Van Kuppeveld FJM et al. Applied and Enviromental
   Microbiology     1992;58:2606-2615.
5. Deng S et al. PCR Methods and Applications 1992;1:202-
   204.

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