Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 1, 1996

DIFERENCIACI N DE Leptospira spp POR PCR

S. Martinez,^1 C. Fernandez,^1 M. Camacho^1 y C. Duarte^2

^1 Departamento de Biologia Molecular, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, apto.10 San Jose de las Lajas, La Habana, Cuba.

^2 Centro Nacional de Epidemiologiay Diagnostico veterinario.

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Introduccion

La leptospirosis es una enfermedad ampliamente distribuida que afecta a los animales y al hombre, siendo frecuentemente mal diagnosticada por lo tanto, el diagnostico se fundamenta mas en los ensayos de laboratorio que solamente en los sintomas clinicos. Los metodos que mas se utilizan se basan en la respuesta serologica aunque en, ocasiones nos brinda respuestas falseadas,de ahi la necesidad de establecer sistemas de diagnosticos alternativo como la hibridacion de acidos nucleicos (1) y la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (2). En este trabajo se utiliza un sistema de PCR para la diferenciacion de cepas patogenas y no patogenas.

Materiales y Metodos

Se utilizaron cepas de referencia y 25 cepas aisladas en Cuba. Los cebadores utilizados fueron tomados de la literatura (4), a partir de la region l6s rRNA de Leptospira interrocrans serovar canicola cepa Moulton. Las muestras fueron procesadas utilizandose diluciones seriadas en base 10 y posteriormente hervidas durante 5 minutos y enfriadas rapidamente en hielo,utilizando 5 microL de la muestra para la reaccion. El volumen de la reaccion de PCR fue de 50 microL. Las reacciones se realizaron en un equipo REACTOR THERMAL-HYBAID y un programa de 31 ciclos. El estudio del producto de amplificacion se realizo mediante una hibridacion de los productos amplificados con un oligonucleotido complementario a esta region.

Resultados y Discusion

Los cebadores utilizados fueron especificos pudiendo diferenciar los grupos de especies patogenas (L. interrogans) de aquellos grupos no patogenos (L. biflexa), lograndose la amplificacion de la banda de 331 pb solo en las patogenas. Cuando se realizo la hibridacion de los productos amplificados se pudo verificar la especificidad de la reaccion de amplificacion, puesto que las muestras positivas mostraron senales en la hibridacion no asi las que fueron negativas por PCR. En muestras de orina y leche de bovino contaminadas experimentalmente se obtuvo amplificacion hasta una dilucion de 10^2 a 10^3 leptospiras, lo cual es adecuado para el diagnostico clinico. Este resultado indica que PCR es mas sensible que los cultivos microbiologicos, como reportan otros autores (2).

Si se tiene en cuenta la necesidad de contar con metodos de deteccion rapidos del microorganismo, necesarios en esta enfermedad de dificil diagnostico microbiologico asi como lo controvertido de la serologia; el contar con tecnicas de alta sensibilidad y especificidad es un elemento de gran valor, sumandosele que a partir de la utilizacion de estas tecnicas pueden implementarse trabajos de epidemiologia molecular basados en los estudios de polimorfismo entre cevas que brindan una mayor informacion a los investigadores junto con la hibridacion de acidos nucleicos y los estudios de secuencias (4). A partir de este trabajo podemos decir que el PCR es un metodo promisorio en la deteccion temprana de la leptospirosis en el hombre y los animales.

1.Terpstra W. J.et al. J. Med. Microbiol. 1986;22:23-28
2.Gravekamp C. et al. In Leptospirosis. Proceedings of the 
   Leptospirosis Research Conference 1990. 151-164. Edited by Y.
   Kobayashi. Tokyo: University of Tokyo Press;1991.
3.Hookey JV FEMS Microbiology Letters 1992;90:267- 274.
4.Gravekamp C. et al. J. of Gen. Microbiology
   1993;139:1691-1700.

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