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Inmovilisation de microrrenina en alumina estodio de adsorcion Miguel Gomez^1 Mabel Alonso^1 y Ruben Ramos^2 ^1 Instituto Superior Politecnico "Jose A. Echeverria", Facultad de Ingenieria Quimica, Marianao, Ciudad de la Habana, Cuba, 19390. ^2 Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, Apartado 6162, Ciudad de la Habana, C.P. 10600, Cuba. Recibido en diciembre de 1994. Aprobado en diciembre de 1995.
Abstract The utilization of immobilized enzymes has opened a new field of application to the industrial use of enzymatic preparations. In this sense, the search of adequate supports has a great importance. The present work deals with a study of the behavior of alumina as a carrier for immobilized enzymes, by the technique of immobilization by adsorption. The grade of fitting of the experimental data, to the theoretical well- known Langmuir's and Freundlich's isotherms, was determined. It was found that the Freundlich's isotherm is the one which better describes the process in the range of the studied concentrations. It was also checked that it is possible the recuperation of the carrier by means of a thermal treatment. Key words: immobilization, rennin, adsorption Resumen La utilizacion de enzimas inmovilizadas ha abierto un nuevo campo de aplicacion al uso industrial de preparados enzimaticos. En este sentido, la busqueda de soportes adecuados tiene una gran importancia. En el presente trabajo se estudia el comportamiento de un tipo de alumina como soporte para enzimas inmovilizadas, mediante la tecnica de inmovilizacion por adsorcion. Se determino el grado de ajuste que poseen los datos experimentales a dos de las isotermas teoricas conocidas, la de Langmuir y la de Freundlich, encontrandose como resultado, que la isoterma de Freundlich es la que mejor describe el proceso en el rango de concentraciones estudiadas. Tambien se comprobo que es posible la recuperacion del soporte a traves de un tratamiento termico. Palabras claves: inmovilizacion, renina, adsorcion Introduccion Los preparados enzimaticos son ampliamente utilizados, en diferentes procesos de importancia economica y una evolucion en este sentido ha sido el uso de las enzimas inmovilizadas, es decir, fijadas de alguna forma a un soporte insoluble, en lugar de su adicion en solucion o en suspension (1). Para la coagulacion de la leche, una consideracion importante es que la estructura del soporte sea porosa (2). Por esta razon, han sido usados la alumina y otros materiales macroporosos con este fin (3). En el presente trabajo se realiza un estudio de adsorcion en alumina de micorrenina, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar la k-caseina presente en la leche y provocar asi la desestabilizacion del sistema y su posterior floculacion. Esto constituye el primer paso en la produccion de quesos, y en el se consumen cantidades importantes de la enzima, con la consiguiente elevacion del costo de fabricacion del producto. La posibilidad de utilizar un sistema donde se encuentre la enzima inmovilizada y a traves del cual pase la materia prima (leche), reduciria consi-derablemente el mencionado costo. Materiales y Metodos Soporte utilizado El soporte utilizado fue alumina Merck, calidad reactivo. Enzima utilizada Se utilizo una micorrenina de Mucor pusillus, obtenida por via recombinante. La enzima fue utilizada en solucion acuosa de NaCl al 15 %. Inmovilizacion de la enzima Teniendo en cuenta la estructura altamente porosa de la alumina, la tecnica utilizada para fijar la enzima al soporte es la inmovilizacion por adsorcion. Este metodo se basa en poner en contacto la solucion enzimatica y el soporte durante un tiempo determinado, suficiente para que el sistema alcance el equilibrio de adsorcion. Determinacion de la concentracion de proteina El metodo utilizado para la determinacion de la concentracion de proteina, tanto de la muestra inicial como del sobrenadante que queda posterior a la inmovilizacion, fue el propuesto por Bradford (4) que utiliza el reactivo Coomassie Brilliant Blue G-250. Determinacion de la actividad enzimatica Para la determinacion de la actividad enzimatica se utilizo el metodo propuesto por Berridge (5, 6), el cual se basa en la comparacion del tiempo de coagulacion de la leche, utilizando una enzima patron, con el tiempo de coagulacion de la misma leche, empleando la enzima que se quiere medir. La actividad enzimatica se expresa en unidades Berridge (UBe). Adsorcion de un soluto a partir de una disolucion. Consideraciones teoricas La adsorcion es, de forma general, el intercambio de materia entre una determinada fase y una superficie solida (7). Esto implica la acumulacion de moleculas de un soluto dado en la interfase solido-fluido. Deben distinguirse dos tipos de fenomenos de adsorcion: la adsorcion fisica y la adsorcion quimica (8). La adsorcion fisica o de Van der Waals es el resultado de la actuacion de fuerzas intermoleculares de atraccion entre las moleculas de un solido y de la sustancia adsorbida. La adsorcion quimica o quimisorcion es el resultado de la interaccion quimica entre el solido y la sustancia adsorbida. Isotermas de adsorcion La adsorcion de una sustancia en una superficie adsorbente esta acompanada por una liberacion de calor, y reciprocamente, la separacion de la sustancia de la superficie, es decir, la desorcion, ocurre con absorcion de calor. La adsorcion sigue el principio de Le Chatelier, o sea, el aumento de temperatura cambia al equilibrio en direccion al proceso endotermico, por lo que la cantidad de sustancia adsorbida disminuye con el aumento de la temperatura y aumenta con la disminucion de la temperatura (9). La cantidad de sustancia adsorbida puede disminuirse o aumentarse a temperatura constante por la disminucion o aumento de la concentracion de adsorbato. La relacion entre la adsorcion y la concentracion a temperatura constante puede representarse graficamente y la curva obtenida se denomina isoterma de adsorcion (8, 9). Existe un gran numero de expresiones que des-criben isotermas de adsorcion, y entre estas, algunas de las mas conocidas son la isoterma de Langmuir y la isoterma de Freundlich. Isoterma de Langmuir Si se hacen las siguientes suposiciones (8): 1. la capa adsorbente saturada es monomolecular, 2. la superficie dada tiene uniformemente dispuestos los centros activos, y entre las moleculas adsorbidas no existen interacciones, 3. la adsorcion maxima corresponde al estado en que la superficie se encuentra totalmente llena de moleculas, la cantidad de sustancia adsorbida puede representarse mediante la siguiente expresion (10):
THETA=G/Gmax=c/(K+c) [1] Esta ecuacion puede linealizarse tomando los inversos de ambos miembros y manipulando algebraicamente queda:
1/G=(1/Gmax)+(K/Gmax)*(1/c) [2] Esta ecuacion representa una linea recta cuya pendiente es K/Gmax, y el intercepto es 1/Gmax, por lo que los valores de las constantes Gmax y K pueden obtenerse por regresion lineal a partir de datos de 1/G vs. 1/c. La ecuacion de Langmuir se corresponde bien con los datos experimentales en el campo de las concentraciones altas y bajas (9); no obstante, esta isoterma no es aplicable a todos los fenomenos de adsorcion. Isoterma de Freundlich Otra ecuacion de la isoterma de adsorcion es la ecuacion empirica denominada isoterma de Freundlich (8), la cual se expresa como:
x/m=k.c1/n [3] donde: x: cantidad de sustancia adsorbida m: masa del adsorbente c: concentracion de equilibrio de adsorbato k y n : constantes Para calcular las constantes, la ecuacion [3] debe linealizarse, lo cual se logra aplicando logaritmos en ambos miembros. De esa forma quedaria:
log(x/m)=log k+(1/n)log c [4] Esta ecuacion representa una linea recta cuya pendiente es 1/n, y su intercepto con el eje de las ordenadas es log k, por lo que los valores de estas constantes pueden obtenerse por regresion lineal a partir de datos de log (x/m) vs. log c (9). Descripcion de los experimentos En cada experimento se utilizo la misma cantidad de alumina (5g), y se realizaron en placas Petri, colocadas en un agitador rotatorio (shaker). Determinacion del tiempo de contacto Para determinar el tiempo en que se alcanza el equilibrio de adsorcion, a dos placas Petri rotuladas como A y B, que contienen alumina, se adicionaron 10 mL de la solucion de enzima y 10 mL de solucion de NaCl al 15 %, y se hicieron determinaciones de concentracion de proteina y de actividad enzimatica en el sobrenadante durante 10 horas a intervalos de 2 horas. Influencia de la concentracion enzimatica inicial en la cantidad de enzima adsorbida A cinco placas con 5 g de alumina previamente humedecida, fueron anadidos los volumenes de solucion de enzima y NaCl al 15 % que se muestran en la Tabla 1. La solucion se preparo en un recipiente aparte, se homogenizo y se anadio a la alumina. Tabla 1. Volumenes de solucion enzimatica y de solucion de NaCl al 15 % utilizados en la preparacion de las soluciones de enzimas de diferentes concentraciones.
Se dejo en contacto el soporte y la solucion de enzima en un shaker con agitacion lenta durante 2 h a 20 C de temperatura. Pasado este tiempo se tomaron muestras del sobrenadante y se determino la concentracion de proteina y la actividad enzimatica por los metodos antes descritos. Influencia del tratamiento termico en la capacidad de adsorcion de la alumina El mismo experimento fue realizado con alumina usada, la cual se sometio a un tratamiento termico a 800 C durante 4 h, con el fin de evaluar su comportamiento en cuanto a la capacidad de adsorber proteinas despues del tratamiento. Resultados y Discusion En todos los experimentos se realizaron determinaciones de concentracion de proteinas y actividad enzimatica de la muestra inicial y del sobrenadante posterior a la inmovilizacion. Se considero que la cantidad de proteina inmovilizada y la actividad enzimatica inmovilizada estan dadas por la diferencia entre las concentraciones iniciales y finales tanto de actividad enzimatica como de proteinas totales. Se realizo un experimento preliminar en el que se siguio el procedimiento descrito anteriormente, pero sin humedecer previamente el soporte. Posteriormente, este experimento fue repetido a las mismas concentraciones de enzima iniciales, pero humedeciendo esta vez la alumina antes de anadir la enzima. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1.
Por otra parte, en la alumina utilizada existen poros grandes, medianos y pequenos, y teniendo en cuenta que la molecula de proteina es mucho mayor que la de agua, habra poros en los que podra adsorberse la molecula de agua, pero no podra hacerlo la proteina. Al mojarse previamente el soporte, todos los poros se saturaran de agua, y al ponerlo posteriormente en contacto con la solucion enzimatica, la competencia del soluto con el disolvente sera solo por aquellos sitios activos del soporte donde puede entrar la proteina. El resto de la superficie activa del soporte permanecera saturada de agua, por lo que no debera ocurrir la adsorcion del disolvente presente en la solucion enzimatica. De esta forma, la cantidad de enzima que se adsorbe, puede estimarse a partir de la diferencia entre la concentracion inicial y final de proteinas en la solucion enzimatica. En la Figura 2 se presentan los resultados del experimento para determinar el tiempo de contacto entre la enzima y el soporte, y en ella se observa que entre 2 y 10 horas no hay variacion de la cantidad de enzima adsorbida, lo cual induce a pensar que a las 2 horas ya se ha alcanzado el equilibrio de adsorcion. Notese que para el caso de la alumina sin mojar, se detecta menor cantidad de proteina adsorbida que en el caso en que esta se moja; ello puede ser una confirmacion de lo planteado anteriormente. Tabla 2. Alumina sin tratar a 800 C.
Tabla 3. Alumina tratada a 800 C.
Placa Act. inic., Act. Final, Act. Adsorbida,
UBe/g sop. UBe/g sop. UBe/g sop.
----------------------------------------------
1 33,66 4,88 14,14
2 67,32 13,25 14,32
3 100,98 20,85 17,56
4 168,30 35,20 27,28
5 336,60 70,00 56,60
Al obtener estos resultados, en los siguientes experimentos se mojo la alumina previamente y se tomo como tiempo de contacto 2 horas. Influencia de la concentracion inicial en la adsorcion de la enzima. Ajuste de las isotermas de adsorcion La influencia de la concentracion inicial en la cantidad de enzima adsorbida por gramo de soporte, es mostrada en las Figuras 3 y 4, en las que se observa que, al aumentar la concentracion inicial de enzima, aumenta la cantidad de esta adsorbida por gramo de soporte, hasta que se satura su superficie, momento en el que un aumento de la cantidad inicial de enzima no produce un aumento de la adsorcion.
A partir de estos datos, se construyeron los graficos de log (x/m) vs. log c, y de 1/(x/m), (proporcional a G), vs. 1/c para comprobar el ajuste de los datos experimentales obtenidos a las isotermas de Freundlich y de Langmuir respectivamente. Estos graficos se muestran en las Figuras 5 a 8, en las que se ven los valores de las constantes de las diferentes isotermas estudiadas, correspondientes a la pendiente e intercepto de las rectas ajustadas en cada caso. Se observa que los datos experimentales corresponden mejor a la isoterma de Freundlich que a la de Langmuir, por lo que puede afirmarse que para el rango de concentraciones estudiadas, es la ecuacion de Freundlich la que mejor describe este proceso.
Este resultado coincide con lo planteado por Ramsden (11), en cuanto a la inaplicabilidad de la isoterma de Langmuir en estos casos, debido probablemente a adsorcion de forma irreversible de cierta cantidad de proteina. Comportamiento de la alumina antes y despues del tratamiento a 800 C Como se observa en las Tablas 2 y 3, en el caso de la alumina tratada termicamente, hay aproximadamente la misma actividad enzimatica adsorbida por gramo de soporte que en el caso de la alumina no tratada, ya que al someter al soporte a una temperatura de 800 C, se eliminan todo tipo de proteinas o componentes organicos que puedan encontrarse adsorbidos en ella, y como consecuencia, es posible la recuperacion del soporte despues de su utilizacion. Conclusiones Los resultados planteados anteriormente, permiten concluir que: 1. Se debe mojar previamente la alumina antes de efectuar la inmovilizacion, para poder estimar la adsorcion de la enzima como la diferencia entre la concentracion inicial y final en el sobrenadante. 2. Se toma como tiempo de contacto para la inmovilizacion 2 horas. 3. Al aumentar la concentracion inicial aumenta la adsorcion de la enzima al soporte, hasta alcanzar un valor de saturacion. 4. En el rango de concentraciones estudiadas, se encontro que los datos experimentales se ajustan satisfactoriamente a la isoterma de adsorcion de Freundlich, no sucediendo lo mismo con la isoterma de Langmuir. 5. Se puede recuperar la alumina utilizada por tratamiento termico de la misma a 800 C, lo cual hace atractivo este soporte desde el punto de vista economico. 1. Woodward J. Immobilised Cells and Enzymes- A Practical Approach, JRL - 1985;Press Limited. 2. Carlson A. Biotechnology Progress 1985:46. 3. Taylor M, et al. Biotechnology and Bioengineering 1977;19:683. 4. Bradford M. Anal Biochem 1976; 72:248. 5. Berridge NJ. Biochem J 1945; 39:179. 6. Berridge NJ. Analyst 1952;77:57. 7. Treybal E. Operaciones con transferencia de masa. Ed. Rev. 1985; 581. 8. Frodorov M. Quimica Coloidal. Ed. Pueblo y Educacion 1983;15. 9. Medvedev PI. Quimica Fisica y Coloidal. Ed. Pedagogica de Cuba 1957; 207. 10. Kohler HH. Thermodynamics of Adsorption from Solution. Ed. Marcel Dekker Inc 1993. 11. Ramsden JJ. Experimental methods for investigating protein adsorption kinetics at surfaces. 88 Quarterly Reviews of Biophysics 1994; 27: 41-105. Copyright 1996 Elfos Scientiae
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