Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 1, 1996, pp. 101-104

Sintesis en fase solida de un peptido fluoresceinado para la determinacion cualitativa de proteasas

Recibido en noviembre de 1995. Aprobado en diciembre de 1995.

Osvaldo Reyes, Ignacio Figueroa, Hilda E Garay, Luis J Gonzalez y Luis J Cruz

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Division de Quimica-Fisica Apartado 6162, C. de la Habana, Cuba.

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Abstract

Modified peptides with some fluorophores have been widely used in molecular biology. To modify a peptide with fluorescein, the coupling is achieved with some derivatives, such as 5- fluorescein isothiocyanate, 4-(iodoacetamido) fluorescein, 5- carboxyfluorescein succinimidyl ester, etc. Nevertheless, the labeling with fluorescein in solid phase is not reported.In this paper the labeling of a peptide with fluorescein, using TBTU strategy in solid phase is presented. The labeled peptide is applied to the protease contaminant determination. In this case we used tripsin as model enzyme. Different protease solutions were incubated four hours with 3 mg of labeled peptide. The analysis was performed by 0.8 % agarose gel electrophoresis in five minutes of run time and 10 pg of protease were detected.

Key words: peptide synthesis, solid phase synthesis, fluorescein, modified peptides, protease contaminant determination

Resumen

Los peptidos derivatizados con agentes fluoroforos han encontrado un amplio uso en los metodos de la biologia molecular. Para modificar un peptido con fluoresceina, el acoplamiento a la secuencia peptidica se rea-liza generalmente en solucion con derivados de esta sustancia, como son: el 5- isotiocianato de fluoresceina, la 4-iodoacetamidofluoresceina, el 5-succinimidil ester de carboxifluoresceina, entre otros. Sin embargo, no se ha reportado el marcaje con este fluoroforo utilizando las estrategias de acoplamiento de la sintesis en fase solida. En este trabajo se presenta la derivatizacion de un peptido con fluoresceina libre mediante la estrategia de activacion con TBTU en fase solida. El peptido marcado se aplica a la determinacion de bajos niveles de actividad proteolitica en una muestra de tripsina. Diferentes cantidades de tripsina se incubaron con 3 mg del peptido marcado durante cuatro horas. El analisis se realizo por electroforesis en un gel de agarosa 0,8 % con cinco minutos de corrida y se detectaron 10 pg de la proteasa.

Palabras claves: sintesis de peptidos, sintesis en fase solida, fluoresceina, peptidos modificados, determinacion de proteasas contaminantes

Introduccion

Las diferentes modificaciones quimicas de los grupos de las cadenas laterales de un peptido sintetico han diversificado la aplicacion en la bioquimica y la biotecnologia de estas moleculas. Especial interes se le comenzo a prestar recientemente al marcaje de peptidos con moleculas coloreadas o agentes fluoroforos. Esto se debe al empleo que han encontrado estos derivados peptidicos en los estudios cineticos y de mecanismos bioquimicos (1, 2), en algunas tecnicas de cromatografia (3, 4), en nuevos metodos para el estudio de sustratos peptidicos (5) y en la determinacion de proteasas (6). En la sintesis en fase solida es conveniente utilizar marcadores coloreados que contengan un grupo -COOH o un -SH para que el acoplamiento se pueda realizar antes de la desproteccion final del peptido. Esto permite introducir las moleculas del colorante en posiciones especificas, como el grupo amino terminal, el grupo epsilum-amino de la lisina o el grupo-SH de la cisteina, mediante reacciones selectivas. Acoplar el colorante a otro grupo funcional de la secuencia (al carboxilo de los acidos aspartico y glutamico, al hidroxilo de la serina y la treonina, al amino de la arginina, etc.) haria muy dificil la sintesis. La limitante fundamental es que no se han encontrado protecciones temporales para estos grupos, que puedan ser eliminadas sin afectar los grupos protectores de las cadenas laterales restantes. La eficiencia necesaria para el acoplamiento de los aminoacidos durante la sintesis de un peptido se asegura con una gran variedad de compuestos con procedimientos establecidos (7- 11). Entre los mas utilizados estan la 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la 1,3-diisopropilcarbodiimida (DIC). Estos activadores generan subproductos poco solubles; pero su empleo es sencillo y poco costoso. Cuando se emplea el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) con DCC o DIC, el intermediario que resulta es mucho mas reactivo que en los casos anteriores. Existen otras vias de activacion del grupo carboxilo, como por ejemplo las sales de derivados del benzotriazol: el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio (BOP), el hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y el hexafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU) (12-14). Este tipo de activacion del grupo carboxilo incrementa los rendimientos de las reacciones, pues resuelve los problemas con la solubilidad de los intermediarios por ser sales ionicas. Ademas, estos intermediarios son mas reactivos. Sin embargo, para derivatizar un peptido con fluoresceina no se reportan tales procedimientos. En el marcaje quimico con este fluoroforo, el acoplamiento se realiza por el grupo amino terminal, el grupo epsilum-amino de la lisina o por el grupo sulfihidrilo de la cisteina con derivados de esta sustancia, como el 5-isotiocianato de fluoresceina (1, 15), la 4-iodoacetamidofluoresceina (1), el 5-succinimidil ester de carboxifluoresceina (16), entre otros. Estas moleculas son dificiles de obtener, por lo que el costo de su utilizacion en una sintesis quimica es relativamente elevado. El objetivo de este trabajo fue la derivatizacion de un peptido con fluoresceina libre, por el grupo epsilum-amino de una lisina, mediante la sintesis en fase solida. Se presenta tambien la aplicacion de este peptido modificado a la determinacion cualitativa, por electroforesis en geles de agarosa, de la actividad proteolitica en una muestra de tripsina.

Materiales y Metodos

Diseno del peptido Se eligio un peptido con la siguiente secuencia:

           Secuencia                     Codigo
------------------------------------------------
        Ac-K(-flu)PLSRTLSVAAK-NH2        p1f

Esta secuencia contiene los sitios de cortes de varias proteasas (17), entre las que se encuentra la tripsina. Esta proteasa fue la escogida como modelo para los ensayos de determinacion de actividad proteolitica con el peptido marcado como sustrato. Para disminuir los problemas de impedimentos estericos de la reaccion del grupo carboxilo de la fluoresceina, se escogio el acoplamiento de la molecula del fluoroforo por el grupo epsilum-amino de la lisina. El grupo amino terminal se acetila previamente. Sintesis del peptido El peptido se sintetizo por el metodo en fase solida, siguiendo la estrategia Boc- en bolsas de polipropileno (Biotech. Instruments, USA) (18). Se utilizaron 100 mg de la resina 4-metilbencilhidrilamina (MBHA) (100-200 mesh, 1-1,2 mmol/g, Fluka, Suiza). Los aminoacidos protegidos con el grupo Boc- (BACHEM, Suiza) se utilizaron a una concentracion de 0,2 mol/L. Todos los solventes (diclorometano, 2-propanol, N,N'-dimetilformamida) y los reactivos empleados (N-etildiisopropilamina, acido trifluoroacetico, p-cresol, anisol, dimetilsulfuro) fueron puros para sintesis (Merck, Alemania) y se utilizaron sin ningun tratamiento previo. Las reacciones de acoplamiento se realizaron por activacion del grupo carboxilo de cada aminoacido con cantidades equivalentes de DIC 0,2 mol/L en diclorometano (DCM). La eficiencia del acoplamiento de los aminoacidos protegidos se verifico con ayuda del ensayo de ninhidrina. En la sintesis se utilizo la Boc-Lys(Fmoc)-OH (BACHEM, Suiza) en la posicion amino terminal del peptido, para la derivatizacion por el grupo de la cadena lateral de este residuo. La eliminacion de la proteccion temporal (Boc-), incluyendo la del NH2-terminal, se realizo por un tratamiento con acido trifluoroacetico al 37,5 % en DCM. En la acetilacion del amino terminal del peptido se utilizo acido acetico 0,2 mol/L en DCM siguiendo la metodologia de acoplamiento de activacion con DIC. Para la reaccion selectiva de la fluoresceina por el grupo epsilum-amino de la lisina en la posicion NH2-terminal, se requirio la eliminacion del grupo protector (Fmoc-) con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida durante 30 min. El acoplamiento selectivo se realizo por la via de activacion con TBTU segun se describe en (10) (aminoacido/ TBTU/HOBt/N- etildiisopropilamina), con la diferencia de que se adiciona fluoresceina en vez de un residuo aminoacidico (fluoresceina/ TBTU/ HOBt/N-etildiisopropilamina). El TBTU y el HOBt se adicionaron equivalente a equivalente con respecto a la fluoresceina, mientras que de la N-etildiisopropilamina se utilizaron tres equivalentes. Todas las soluciones se prepararon 0,2 mol/L en DCM, excepto la de N-etildiisopropilamina (0,6 mol/L). El completamiento de la reaccion se verifico por el ensayo de ninhidrina. El tiempo de reaccion fue de ocho horas. El procedimiento empleado para la desproteccion final fue el conocido como Low-High HF . Para este fin se utilizo HF (fluoruro de hidrogeno) puro para analisis (Fluka, Suiza) con las mezclas correspondientes de agentes nucleofilicos (19). Posteriormente la bolsa se lavo con eter dietilico y se seco al vacio. Al producto final crudo se le realizo la extraccion del peptido con acido acetico al 30%. El extracto final se diluyo con agua y se liofilizo. Cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) El peptido fue analizado por HPLC (LKB, Pharmacia) con una columna RP C18 VYDAC (4,6 x 100 mm). Se utilizo un gradiente de 5-60 % de acetonitrilo (0,05 % de TFA) en agua (0,1 % de TFA) en 30 min. La purificacion se realizo con un gradiente similar en una columna RP C18 VYDAC (10 x 250 mm). El peptido derivatizado se detecto a una longitud de onda de 226 nm. Espectrometria de masas El espectro de masas se obtuvo en un equipo de doble sector (JEOL HX-110HF). La fuente de ionizacion fue un canon FABMS-FAB11. Se utilizo xenon ultrapuro como gas de bombardeo. Determinacion cualitativa de la actividad proteolitica por electroforesis Para la determinacion de la actividad proteolitica se incubaron varias muestras con diferentes cantidades de tripsina (1 ng; 0,5 ng; 0,1 ng; 0,05 ng y 0,01 ng) y 3 ug del peptido marcado. El tiempo de incubacion fue de cuatro horas a temperatura ambiente. El volumen total de cada muestra fue de 20 uL. Las corridas electroforeticas se realizaron en geles de agarosa al 0,8 % bajo una diferencia de potencial de 100 V en cinco min. Como buffer de corrida se empleo Tris-HCl a una concentracion de 50 mmol/L con pH = 8. Las bandas electroforeticas se detectaron en una lampara UV de 265 nm de longitud de onda. Resultados y Discusion

Sintesis del peptido derivatizado con fluoresceina El acoplamiento del colorante inicialmente se realizo por la via de activacion con DIC y posteriormente en la presencia de HOBt. El ensayo de ninhidrina en ambos casos demostro una elevada presencia de grupos aminos libres y por tanto, el rendimiento del acoplamiento fue muy bajo. Esto podria explicarse si se tiene en cuenta que el grupo carboxilo de la fluoresceina esta impedido estericamente. Ademas, es conocido (20) que esta molecula puede estar formando un ciclo que incluye al grupo carboxilo. Por esta razon es posible que este poco accesible a una activacion. Debido a la baja reactividad del grupo carboxilo de la fluoresceina, para lograr su acoplamiento se recurrio a la via de activacion con TBTU. Con este agente es mucho mas fuerte la activacion del grupo carboxilo y por tanto el intermediario que se forma es significativamente mas reactivo. El completamiento de la reaccion se estimo en mas de un 95 %, segun los resultados del ensayo de ninhidrina. Figura 1. Cromatograma del peptido p1f derivatizado con fluoresceina. Se utilizo una columna de fase reversa C18 VYDAC (4,6 x 100 mm) con un gradiente de 5-60 % de acetonitrilo (0,05 % de TFA) en agua (0,1 % de TFA) en 30 min. El peptido derivatizado se detecto a una longitud de onda de 226 nm. En la Figura 1 se presenta el cromatograma del peptido p1f (producto crudo de la sintesis) detectado a 226 nm de longitud de onda. El peptido se purifico y el pico principal se analizo por espectrometria de masas. Del resultado del analisis por bombardeo con atomos rapidos se demostro que la relacion M/Z calculada (igual a 1 626,1) se correspondio con la senal pseudomolecular M + 1 (M/Z experimental igual a 1 626,1). Determinacion cualitativa de actividad proteolitica con el peptido fluoresceinado en una muestra modelo El analisis cualitativo se basa en el seguimiento por electroforesis de la proteolisis de un peptido sintetico. Este al ser degradado modifica su carga y longitud, por lo que su desplazamiento en un gel de agarosa en condiciones preestablecidas, sera diferente. Las bandas son detectadas por la coloracion (o fluorescencia) del marcador acoplado al peptido. En dependencia de la secuencia especifica del corte de la proteasa, puede disenarse un peptido para cada contaminante de este tipo. Tambien existe la posibilidad de que una secuencia disenada sea capaz de determinar dos tipos de proteasas. Lo planteado anteriormente demuestra la versatilidad del metodo. Figura 2. Determinacion cualitativa de la presencia de tripsina en una muestra modelo. En un volumen de 20 uL se incubaron cantidades diferentes de tripsina con 3 mg/muestra del peptido marcado. El tiempo de incubacion fue de cuatro horas a temperatura ambiente. Para la deteccion de la migracion electroforetica de las bandas fueron suficientes 5 min bajo una diferencia de potencial de 100 V. Como control negativo se utilizo el peptido incubado en el buffer 50 mmol/L de Tris.HCl. El peptido intacto esta representado por F y el fragmento F1 es el subproducto marcado de la proteolisis. El peptido intacto tiene carga +1, ya que la fluoresceina en solucion a pH 8,0 esta cargada negativamente y el grupo carboxilo terminal esta en forma de amida. Por lo tanto la molecula intacta debe migrar hacia el catodo. De acuerdo a las caracteristicas del corte de la tripsina (en el grupo carboxilo terminal de K o R), el resultado de la proteolisis del peptido marcado debe ser el siguiente: 1. peptido intacto: Ac-K(flu)PLSRTLSVAAK-NH2 2. carga total: +1 3. fragmento F1: Ac - K(flu)PLSR - COOH 4. carga total: -1 Los resultados de la determinacion para cuatro horas de incubacion se muestran en la Figura 2. El fragmento F1 resultante de la proteolisis migra hacia el anodo. La intensidad de la banda del fragmento F1 depende de la cantidad de proteasa presente en las condiciones establecidas de reaccion. Por otra parte, mientras que el proceso de la proteolisis no sea completo, deben aparecer las bandas del peptido intacto. Para detectar niveles de contaminacion por debajo de los 10 pg de proteasa, la reaccion de incubacion debe extenderse a mayores tiempos. La muestra que contiene 1 ng de tripsina funciona como control positivo, ya que la degradacion proteolitica de la cantidad del peptido aplicada es practicamente completa. El control negativo es una incubacion del buffer con el peptido sin tripsina. La metodologia de la utilizacion de un peptido derivatizado con fluoresceina para el estudio de la actividad proteolitica en una muestra modelo de tripsina es aplicable a soluciones y a liofilizados. Este tipo de analisis es util tanto para la determinacion cualitativa de los niveles de contaminacion como para establecer los requerimientos de almacenaje y conservacion de diferentes preparados. Los resultados del diseno de nuevos peptidos marcados y la aplicacion al estudio de muestras proteinicas de algunos de los procesos mas importantes de nuestro centro, se encuentran en preparacion para una proxima publicacion.

Conclusiones

Con el empleo del TBTU como agente activador del grupo carboxilo de la fluoresceina libre, se logro acoplar este fluoroforo al peptido en fase solida. Segun los resultados del ensayo de ninhidrina, el analisis por RP HPLC y espectrometria de masas, el acoplamiento en fase solida se efectua de manera eficiente similar a cualquier residuo aminoacidico que se emplea en la sintesis de peptidos. Esto ultimo constituye la ventaja fundamental sobre los demas metodos de obtencion de peptidos derivatizados con fluoresceina. Se demostro la utilidad del peptido marcado en la determinacion cualitativa de la presencia de una proteasa contaminante. Se detectaron por la metodologia presentada hasta 10 pg de tripsina en cuatro horas de incubacion con 3 ug del peptido derivatizado.

Agradecimientos

Agradecemos la ayuda muy profesional del Sr. Jesus Seoany en los detalles precisos de la fotografia y la atencion especial de la Dra. Lila Castellanos en la revision de este articulo.

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