Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 2, 1996, pp. 105-108

Deteccion de la infeccion por VIH mediante la RCP en muestras de seca en papel de filtro

Felipe Rolo Gomez, Jorge Mato Luis, Madeline Blanco de Armas, Hector Diaz Torres y Ana Luisa Lubian Caballero

Recibido en abril de 1995. Aprobado en diciembre de 1995.

Laboratorio de Investigaciones del SIDA, Apartado 23031, La Habana 14, Cuba.

Code Number: BA96041
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Abstract

Blood sampling on filter paper has many advantages to detect antibodies to HIV. To evaluate this method for the detection of proviral DNA by the polimerase chain reaction (PCR) technique we have studied 50 dried blood samples from HIV-1 seropositive individuals including children born from HIV infected women, and 60samples from normal blood donors. The 92 % of seropositives were positive with the PCR technique, no positives were found among seronegative people. The PCR technique was useful to elucidate the perinatal infection. The applied procedure allowed us to detect proviral DNA from dried blood spots on filter paper.

Key words: polymerase chain reaction (PCR), HIV-1, dried blood spots

Resumen

La sangre seca en papel de filtro constituye una muestra adecuada para la deteccion de anticuerpos contra el VIH. El presente trabajo se realizo con el objetivo de evaluar su utilidad en la deteccion del ADN proviral. Se estudiaron 50 muestras de sangre seca de seropositivos al VIH-1, entre las cuales se incluyeron ninos nacidos de madres seropositivas; conjuntamente se estudiaron 60 muestras procedentes de donantes de sangre voluntarios. El 92 % de los seropositivos analizados resultaron positivos por la tecnica de RCP, no se encontro positividad entre los seronegativos, el seguimiento clinico y serologico de los ninos confirmo la utilidad de esta tecnica para evaluar la infeccion perinatal en los casos estudiados. El procedimiento empleado resulto util en la deteccion del ADN proviral a partir de la sangre seca en papel de filtro.

Palabras claves: reaccion en cadena de la polimerasa, VIH-1, sangre seca en papel de filtro

Introduccion

La tecnica de colectar sangre en papel de filtro facilita la realizacion de programas seroepidemiologicos porque simplifica el traslado de las muestras desde lugares distantes hasta un laboratorio central sin necesidad de refrigeracion ni cuidados especiales, implica un menor riesgo biologico, ademas de facilitar su almacenamiento y conservacion sin que se afecte la estabilidad. Debido a estas caracteristicas, este tipo de muestra se utiliza en programas de deteccion precoz de diferentes enfermedades de origen genetico y metabolico en ninos recien nacidos, ya que no se requiere puncion venosa y la cantidad de sangre necesaria es pequena (1, 2). En el diagnostico del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se ha utilizado con bastante exito la sangre colectada en papel de filtro para la deteccion de anticuerpos especificos antivirales (3-5), lo cual permite establecer la seroprevalencia de anticuerpos en la poblacion estudiada, sin embargo, no permite diferenciar en el caso de los ninos, si los anticuerpos detectados son de origen materno o propios, por lo que se necesitan otras tecnicas como la reaccion en cadena de la polimerasa (RCP) que establece el criterio de infeccion mediante la demostracion del ADN proviral. La RCP tiene tambien utilidad en aquellos casos en que el patron serologico resulta indeterminado, como por ejemplo en la seroconversion temprana. En trabajos recientes se reporta la deteccion del ADN proviral a partir de sangre seca en papel de filtro, en muestras preparadas con una linea celular infectada diluida en sangre total seronegativa y en muestras clinicas procedentes de ninos nacidos de madres seropositivas o a partir de discos de papel de filtro embebidos en sangre tomada con anticoagulante (6-8). En el presente trabajo nos propusimos estimar la efectividad del procedimiento para la extraccion del ADN a partir de sangre seca en papel de filtro, adaptado para las condiciones de realizacion de la RCP en nuestro laboratorio, utilizando por primera vez muestras clinicas de adultos seropositivos asintomaticos tomadas directamente por puncion digital.

Materiales y Metodos

Pacientes

Se seleccionaron 41 individuos seropositivos asintomaticos que se encontraban bajo seguimiento clinico y serologico, los cuales dieron su aprobacion para el estudio, y 9 ninos entre 6 meses y 2 anos de edad nacidos de madres seropositivas para los que se pidio el consentimiento de los padres y que fueron objeto de seguimiento por 2 anos. Paralelamente se estudiaron 60 donantes de sangre voluntarios, seronegativos al VIH. El estudio serologico de las muestras se realizo mediante un ELISA (Vironostika anti HTLV-III) y la confirmacion mediante Western blot con el estuche Davih-Blot.

Obtencion de la muestra

La muestra de sangre para papel de filtro se obtuvo por puncion con lanceta estril, previa desinfeccion, del pulpejo del dedo pulgar en los adultos y del area del calcaneo en los ninos. Luego de colectar la sangre en los discos de 1 cm de diametro del papel de filtro No. 903 (Schleicher and Schuell), estos se dejaron secar a temperatura ambiente y se conservaron en una desecadora hasta su procesamiento. La obtencion de sangre venosa y el aislamiento de celulas mononucleares para el procedimiento original de RCP se realizo segdn Ou, et al., (9).

Extraccion del ADN

La extraccion del ADN se realizo mediante una modificacion de la tecnica empleada por Cassol, et al. (8), segun se describe a continuacion. La elucion de la sangre total por incubacion de los discos de papel de filtro (2 por cada muestra) se realizo en 1 mL de solucion amortiguadora para la digestion enzimatica, que contenia tris HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, NaCl 10 mM, SDS 2 % y 0,3 ug/mL de proteinasa K, con incubacion a 37 C durante toda la noche. La sangre eluida y digerida se paso a un tubo limpio donde se anadieron 5 ug de ARN de transferencia de E. coli como portador y se hizo extraccion con igual volumen de la mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamRlico (25:24:1); la fase acuosa se trato de igual forma por segunda vez y por ultimo se trato solo con cloroformo. Estos pasos de extraccion fueron dados sin empleo de vortex. El sobrenadante se paso a otro tubo donde se precipito el ADN durante 2 horas a temperatura ambiente con agitacion lenta en 2 voldmenes de etanol al 100 % mas 1/3 de volumen de acetato de amonio 2,5 M y 10 uL de silica Base Binder (Applied Biosystems). Para recobrar el ADN precipitado en la resina se centrifugo 5 min a 100 000 rpm, el sedimento se resuspendio en 30 uL de agua destilada y se incubo 30 min a 42 C, se centrifugo nuevamente y el sobrenadante se aplico sobre un ultrafiltro MC (Millipore), este paso se repitio y ambos sobrenadantes (60 ul) se unieron y conservaron a -20 C hasta su analisis. La extraccion del ADN a partir de las celulas mononucleares se realizo sin modificaciones de la tecnica original (10). La calidad y recobrado del ADN en ambos casos se comprobo en gel de agarosa al 0,8 % (Sea Plaque) tenido con bromuro de etidio.

Amplificacion del ADN

La RCP se realizo a partir de alicuotas (25 uL) del sobrenadante hervido a 100 C durante 10 min enfriado en hielo a 4 C, recalentado a 80 C y unido con la mezcla de reaccion precalentada, para un volumen final de 100 uL que contenia Tris-HCL 10 mM, KCl 50 mM, Tween 20 0,25 %, Nonidet P-40 0,25 %, MgCl2 2,5 mM, dNTPs 0,2 mM cada uno, 200 pmol de cada oligonucleotido y 2,5 U de Taq Polimerasa (Perkin Elmer Cetus). Se utilizaron dos juegos de oligonucleotidos: el SK145/SK150 que reconoce la secuencia de consenso en el gen gag del VIH-1 y 2 (10) y el SK38/SK39 que reconoce solamente secuencias del gen gag del VIH-1, ver Tabla 1 (9, 11). En cada amplificacion se incluyo un control positivo, que contenia entre 6 y 10 copias de un ADN proviral para evaluar la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba, asR como un control de reactivos (mezcla de reaccion sin ADN) y un control negativo de ADN de linfocitos no infectados. La reaccion de amplificacion se realizo en un equipo automatico regulable para ciclos de temperatura (Hybaid), siguiendo un programa con tres temperaturas en que ocurre la desnaturalizacion, el alineamiento de los oligonucleotidos y su extension, el cual se aplico de la siguiente forma:

Para los oligonucleotidos SK 38/39, 1 ciclo a 95 C, 56 C y 72 C, 1 min en cada paso, respectivamente, 30 ciclos a 95 C -1 min, 56 C -30 s y 72 C -1 min y 1 ciclo de extension final de 10 min a 72 C. Un programa similar en que solo se vario la temperatura de alineamiento en 2 grados mas, es decir, 58 C, se utilizo para los oligonucleotidos SK145/150. En las mismas condiciones se realizo la RCP a partir de 1 ug de ADN extraido del lisado de las celulas mononucleares segun el procedimiento utilizado tradicionalmente en nuestro laboratorio a partir de sangre obtenida con anticoagulante. Todas las muestras fueron amplificadas con los 2 juegos de oligonucleotidos y para ser considerada como positiva una muestra, debio cumplir el requisito de ser positiva con ambos juegos (9).

Tabla 1. Oligonucleotidos empleados como cebadores y sondas en la RCP.

Oligonucleotidos
(orientacion)                  Secuencia                   Posicion
-----------------------------------------------------------------------------------
 SK 38  (+)     ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT               1 541-1 578
 SK 39  (-)     TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC               1 665-1 638
 SK 19  (+)     ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC  1 595-1 635
 SK 145 (+)     AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT             1 366-1 395(1)
                                                           1 121-1 150(2)
 SK 150 (-)     TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC               1 507-1 480(1)
                                                           1 259-1 232(2)
 SK 102 (+)     GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT          1 403-1 435(1)
                                                           1 158-1 190(2)

Los productos de amplificacion se observaron en gel de agarosa (Sea Plaque) al 0,8 % y 1/3 de cada reaccion se sometio a hibridacion en solucion con sondas marcadas (SK102/SK19) que identifican respectivamente sendas secuencias internas en las regiones marcadas por los 2 juegos de oligonucleotidos descritos anteriormente. Las condiciones de hibridacion fueron las mismas que se emplean en la tecnica tradicional (9). Para evitar contaminaciones se tomaron en cuenta las recomendaciones de KwoK (12). Los productos de la hibridacion se separaron en gel de poliacrilamida al 10 % y se detectaron mediante autorradiografia con pantalla intensificadora durante toda la noche a -70 C.

Resultados y Discusion

Calidad y recobrado del ADN

El recobrado de ADN logrado por nosotros a partir de la sangre seca en papel de filtro, utilizando la silica (Base Binder) durante la precipitacion y haciendo la extraccion organica sin el empleo de vortex, fue de 0,8 ug, estando al mismo nivel que el reportado por Cassol et al., (8); esto fue posible aun cuando solo empleamos 2 filtros de 1 cm de diametro por cada paciente, por lo que consideramos que las modificaciones realizadas en este trabajo garantizan mayor eficiencia en el recobrado de ADN, asi como su adecuada integridad, lo cual permitio su ulterior amplificacion. Yourno (7) en 1993 reporto el empleo de los filtros de sangre seca para la extraccion de ADN, luego de haber sido utilizados para la deteccion de anticuerpos, aunque los valores alcanzados fueron inferiores a los reportados por Cassol et al., (8). Estos autores emplearon como medida de control de calidad, para el ADN genomico obtenido del papel de filtro, una tecnica de amplificacion y deteccion por hibridacion con sondas marcadas, previo a su amplificacion especifica para el VIH. En nuestro caso esto no fue necesario y solamente utilizamos la tincion con bromuro de etidio (Figura 1, resultado tipo) para comprobar que el ADN recobrado era adecuado y en cantidad suficiente para su empleo en la RCP.

El hecho de que el ADN genomico obtenido del papel de filtro sea amplificado previamente para secuencias especificas del genoma humano, habla a favor de su calidad y de la ausencia de posibles inhibidores en la muestra; no obstante, la representatividad de dicha muestra para la deteccion del VIH sigue siendo dependiente de la cantidad de particulas virales (blanco) que pudieran estar presentes en la sangre periferica del paciente; debido a esto la optimizacion de la RCP y la reproducibilidad de sus resultados con los controles adecuados, deben garantizar la no ocurrencia de falsos negativos, ya que otras medidas como las mencionadas anteriormente, pudieran emplearse en aquellos casos con resultados discrepantes o indeterminados en la RCP, pero no deben incluirse de rutina en el laboratorio, pues encarecen adn mas esta tecnica que ya de hecho no resulta accesible a todos.

Sangre seca vs. sangre fresca

En relacion con la RCP, los resultados alcanzados con las muestras colectadas en papel de filtro, demostraron que el nivel de sensibilidad y especificidad fue equivalente al logrado con la muestra tradicional, ya que en ambos casos, del total de 50 seropositivos analizados, 46 fueron positivos con ambos juegos de oligonucleotidos y solamente 4 muestras resultaron negativas al no observarse el producto de amplificacion esperado con ninguno de los dos juegos de oligonucleotidos empleados y su correspondiente sonda, dichas muestras negativas corresponden a 4 de los ninos estudiados. En la Figura 2 se observan los resultados de la RCP a partir de papel de filtro, con el juego de oligonucleotidos SK 38/39 a manera de ejemplo.

Las 60 muestras de donantes seronegativos fueron negativas. Estos resultados demuestran que el procedimiento empleado para la extraccion del ADN a partir de la sangre seca fue eficiente y pudiera ser aplicado para estudios en muestras clinicas tanto en ninos como en adultos. En el caso de los adultos, este es el primer trabajo que agrupa muestras clinicas, tomadas directamente por puncion digital en diferentes hospitales, para luego ser trasladadas al Laboratorio de Referencia donde fueron procesadas. En trabajos anteriores estas condiciones habian sido simuladas (8) y se reportaban resultados superiores con la RCP en papel de filtro, con respecto a la muestra tradicional, por lo que se planteaba la necesidad de ampliar estos estudios, con fines de demostrar el valor diagnostico y pronostico de la tecnica con respecto a otras pruebas como las serologicas. En nuestro estudio podemos afirmar que hubo una buena correlacion entre los resultados con ambas RCP, el cual fue del 100 %.

RCP en papel de filtro y correlacion clinico-seroligica

Al comparar los resultados de la RCP en papel de filtro con la serologia, observamos que hubo discrepancia en los 4 casos mencionados anteriormente correspondientes a 4 de los ninos estudiados, esto pudiera atribuirse a que realmente no estaban infectados sino que se trataba de una transferencia pasiva de anticuerpos anti-VIH maternos lo que se comprobo posteriormente con el seguimiento serologico y clinico de dichos ninos, en los cuales el patron de reactividad en el Western blot se fue modificando hasta una total serorreversion y su estado de salud actual es satisfactorio, por lo que se consideraron como seronegativos al concluir este estudio. De los 5 niZos que resultaron positivos por ambas RCP, 2 contindan en fase de seguimiento pues siguen siendo positivos de acuerdo al patron de reactividad de Western blot, los 3 restantes evolucionaron como verdaderos infectados y 1 de ellos fallecio.

Figura 1. Gel de agarosa al 0,8 % tenido con bromuro de etidio. La flecha indica el ADN recobrado de las muestras en papel de filtro. A la derecha se observa el PPM cuya banda superior es de 1114 pares de bases y tiene una concentracion de 0,5 ug /mL.

Figura 2. Autorradiografia de los productos de la RCP realizada con los oligonucleotidos SK 38/39. Las lineas de la 1 a la 3 son diluciones del control positivo (ADN) de una linea celular infectada por el VIH-1, la linea 4 corresponde al control de reactivo (mezcla de reaccion sin ADN), las lineas 5-9 corres-ponden a la banda de amplificacion de muestras de ADN de sangre seca en papel de filtro, de los 5 ninos que resultaron positivos, con talla de 115 pb, linea 10 control negativo (ADN de linfocitos no infectados).

Estos resultados coinciden con los de otros autores que han encontrado una estrecha correlacion entre la presencia del ADN proviral en sangre periferica y la de los anticuerpos especificos antivirales en el suero o plasma de las personas analizadas (13-16); de igual forma se reporta el empleo del papel de filtro con resultados satisfactorios en el esclarecimiento de la infeccion en los ninos nacidos de madres seropositivas (6). Como resultado del incremento que existe en la transmision heterosexual del VIH, actualmente la poblacion femenina y los ninos nacidos de mujeres infectadas constituyen uno de los grupos mas importantes entre los pacientes con SIDA, la OMS estima que para el ano 2000 alrededor de 20 millones de mujeres estaran infectadas por VIH y 10 millones de ninos adquiriran esta infeccion por via perinatal (3); la mayoria de estas infecciones ocurriran en paises del Tercer Mundo, por lo cual resulta de interes el empleo de tecnicas que faciliten la toma de muestra y el traslado de las mismas hacia los laboratorios con fines de investigar y apreciar el impacto que se va produciendo en las diferentes regiones y poder trazar estrategias para aliviar las necesidades de salud. La RCP a partir de sangre seca en papel de filtro pudiera jugar un papel importante en el estudio de esta problematica a nivel mundial.

El procedimiento empleado por nosotros resulto eficiente para la deteccion del ADN proviral, tanto en los adultos seropositivos asintomaticos como en los ninos nacidos de madres seropositivas, por lo que pudiera ser utilizado en estudios posteriores sobre transmision vertical. Se requieren otras investigaciones para evaluar su posible uso en los estudios sobre caracterizacion genetica del VIH.

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