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Biotecnologia Aplicada
Elfos Scientiae
ISSN: 0684-4551
Vol. 13, Num. 3, 1996, pp. 190-194
Biotecnologia Aplicada 1996 Volume 13 No. 3, pp.190- 194

TIEMPO DE VIDA DEL INTERFERON ALFA 2B HUMANO RECOMBINANTE EN DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO

Daisy Barberia, Maribel Vega, Joel Ferrero, Lady Duany, Galina Moya, Tania Curras, Maida Martinez, Asterio Cruz, Miriela Gil y Marisel Quintana

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, Ave. 31 entre 158 y 190, Playa, Apartado postal 6162, Ciudad de La Habana, Cuba.

Code Number:BA96076
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Abstract

This report shows the stability test studies under accelerated and normal storage conditions carried out with recombinant human alpha 2b interferon (hu-r alpha 2b IFN) in phosphate buffer 0.1M, pH 7.0, with and without albumin, in order to establish its shelf-life at refrigerating and frozen condiions. According to the accelerated study we concluded that no alterations will interfere the recognition of hu-r alpha 2b IFN in ELISA in at least five years when stored at -70 or -20 C. Otherwise, when stored at 4 C, a loss of a 10 % may occur in one year. We corroborated this when the presence of new structures which might affect the protein immunological recognition were detected by RP-HPLC. No stabilizing properties of albumin on hu-r alpha 2b IFN were observed at least when it is in phosphate buffer 0.1M, pH 7.0 and under accelerated storing conditions.

Key words: stability, inactivation, denaturation, alpha IFN

Resumen

Este trabajo presenta un estudio de estabilidad acelerada realizado al interferon alfa 2b humano recombinante (IFN alfa 2b hu-r) en tampon fosfato 0,1M, pH 7,0 bajo condiciones reales de almacenamiento para determinar su tiempo de durabilidad en condiciones de refrigeracion y de congelacion. Se probaron dos variantes de almacenaje: en presencia o en ausencia de albumina humana. Del estudio acelerado se obtuvo que en el ensayo ELISA despues de cinco anos almacenado a las temperaturas de -20 o -70 C no ocurren alteraciones que impidan el reconocimiento del IFN alfa 2b hu-r. Si se almacena a 4 C la perdida del 10 % puede ocurrir al cabo de un ano aproximadamente. Esto se corroboro por almacenamiento a 4 C en tiempo real monitoreado por HPLC-RP donde se observo que al ano aparecen nuevas estructuras que pueden interferir en el reconocimiento. Los resultados mostraron que la albumina no posee propiedades estabilizantes sobre el IFN alfa 2b hu-r al menos cuando este se encuentra en tampon fosfato 0,1M, pH 7,0 y bajo condiciones aceleradas de almacenamiento.

Palabras claves: estabilidad, inactivacion, desnaturalizacion, IFN alfa

Introduccion

El interferon alfa es conocido por su efecto antiviral y antiproliferativo. Este se ha podido obtener por la via del ADN recombinante (IFN alfa 2b hu-r). Con el objetivo de determinar el tiempo y la temperatura de almacenamiento de esta proteina se realizo un estudio de estabilidad bajo condiciones aceleradas (1). La importancia de este estudio radica en que se obtiene valiosa informacion en poco tiempo; en los estudios de preformulacion, es el mas usado para comparar la estabilidad de proteinas en presencia de distintos tipos de estabilizantes, excipientes o aditivos (2). Dado su caracter predictivo, es necesario llevar a cabo un estudio de estabilidad en tiempo real para verificar los resultados obtenidos. Este estudio es el que ofrece una informacion mas exacta del comportamiento del producto a la temperatura de almacenamiento establecida (3). En este ultimo caso, se hace necesario no solo determinar la perdida de la actividad, potencia o concentracion en el tiempo a una temperatura dada de almacenamiento, sino tambien para detectar degradacion se deben emplear otros metodos indicadores de la estabilidad del producto, algunos de los cuales han sido descritos para las proteinas recombinantes (4). Para ellas es necesario emplear un gran numero de analisis rigurosos con vistas a asegurar que su estructura, pureza, potencia y actividad de la proteina sean similares a la inicial (5).

La funcion estabilizante de la albumina humana sobre biomoleculas se ha destacado por diferentes autores (6). Se ha empleado para la estabilizacion de proteinas en la fase de investigacion y muchas veces en los productos farmaceuticos, por ejemplo, un exceso de albumina en la formulacion final de interleucina 2 recombinante producida por Cetus Corporation (EE. UU.) logro estabilizar la preparacion liofilizada (7).

El presente trabajo muestra los resultados de un estudio de estabilidad del IFN alfa 2b hu-r bajo condiciones aceleradas y bajo condiciones reales de almacenamiento (4, -20 y -70 C) tanto en presencia como en ausencia de albumina.

Materiales

IFN alfa 2b hu-r

Se estudio en tampon fosfato 0,1M, pH 7,0. El material se dividio en dos partes, a una se le adiciono albumina humana como preservante. El envase se realizo en condiciones esteriles.

Albumina humana

Solucion al 20 % en volumen (Infusion IV, IMEFA, Cuba).

Metodos

Elisa

La concentracion del IFN alfa 2b hu-r en el tiempo de estudio se analizo mediante ensayo inmunoenzimatico tipo "sandwich" para la cuantificacion del IFN alfa 2b hu-r. El ensayo emplea 2 anticuerpos monoclonales producidos en el CIGB (Anti-Human Alfa 2 IFN CB-IFNA 2.3 y Anti-Human Alfa 2 IFN CB-IFNA HRP 2.4). La lectura de la placa se realizo a 492 nm en un MULTISKAN PLUS-ANTHOS (8).

Titulacion

Este metodo se basa en la capacidad de los IFNs para prevenir la infeccion y destruccion de celulas Hep-2 (Carcinoma laringeo humano, ATCC No. CCL 23) provocada por el virus mengo (9).

Electroforesis vertical con SDS en gel de poliacrilamida

Se utilizo el gel a una concentracion de 12,5 % de poliacrilamida. Las muestras se procesaron en condiciones reducidas. Se aplicaron 20 g de proteinas totales. La corrida electroforetica se realizo bajo una intensidad de corriente constante de 30 mA y voltaje inicial de 120 volt, en una fuente de alimentacion para electroforesis (PHARMACIA, Suecia). La tincion del gel se realizo con azul de Comassie G- 250 (10).

Cromatografia liquida de alta resolucion en fase reversa

Se llevo a cabo segun la tecnica reportada por Moya G, et al. (11). Se utilizo un sistema de HPLC LKB (Bromma, Suecia). Las separaciones se efectuaron en columna Wide pore C8 (4,6 x 100 mm, 5um) J.T. Baker (EE. UU.). Las soluciones empleadas fueron: A (acido trifluroacetico-TFA- 0,1 % en agua para HPLC) y B (TFA 0,05 % en acetonitrilo), utilizando un gradiente desde 15 % de B hasta 60 % B, en 40 min con un flujo de trabajo de 0,8 mL/min. La temperatura se mantuvo a 34 C y la absorbancia fue monitoreada a 226 nm. La

adquisicion y procesamiento de los datos se realizaron empleando el programa BIOCROM (CIGB, Cuba) (12).

Estabilidad acelerada

El estudio se baso en exponer las muestras a elevadas temperaturas (28, 45 y 55 C), determinar los parametros cineticos de la degradacion en cada temperatura y usarlos para el ploteo de la ecuacion de Arrhenius. Los parametros de esta ultima, determinados experimentalmente, fueron empleados para predecir la velocidad de degradacion en condiciones de refrigeracion (13).

Estabilidad bajo condiciones reales de almacenamiento

Se llevo a cabo bajo condiciones controladas de temperatura (4, -20 y -70 C), para corroborar los requerimientos de almacenaje propuestos en el estudio de estabilidad acelerado. Se emplearon metodos validados para detectar variaciones de la actividad biologica y la estructura y pureza de la molecula durante el tiempo de almacenamiento (14).

Resultados y Discusion

El estudio de estabilidad acelerada se realizo al IFN alfa 2b hu-r en presencia o en ausencia de albumina humana. Las concentraciones de IFN alfa 2b hu-r determinadas en las muestras durante el almacenamiento se procesaron por el programa BIOEST2 (15). Este programa calcula las constantes de la velocidad de degradacion para cada temperatura estudiada a partir del grafico ln de la concentracion vs. tiempo (Figura 1) con las cuales ajusta graficamente la ecuacion de Arrhenius (3).

    Figura 1. Variacion de la concentracion ( g/mL) del interferon alfa humano recombinante en tampon fosfato (0,1M) para cada temperatura con respecto al tiempo (dias). Temperaturas: (x) 28 C (k = 0,0154 dias^-1), (*) 45 C (k = 0,0827 dias^-1), 55 C (k = 0,7795 dias^-1).
    Eje x: Ln de la concentracion
    Eje y: Tiempo expresado en dias

Extrapolando en este grafico se estima la constante de velocidad de degradacion de la temperatura de almacenamiento propuesta para predecir el tiempo de vida util del producto. Segun el BIOEST2 la cinetica de degradacion correspondio a una reaccion de primer orden. Esto implica que la velocidad con que decrece el numero de moleculas que no sufren cambios es proporcional al numero de ellas que permanecen intactas, es decir, el parametro evaluado decae de forma exponencial con el tiempo (1).

Para la temperatura de refrigeracion (2 -8 C) se predijo que el producto puede perder un 10 % de su concentracion al cabo del ano aproximadamente. Los resultados fueron similares para el material en presencia de albumina.

Igualmente no hubo diferencias para ambas condiciones de almacenamiento al hacer la prediccion en condiciones de congelacion (-70 C). En este caso el almacenamiento se puede extender hasta cinco anos.

La comparacion estadistica mediante analisis de varianza bifactorial (16) utilizando el estadigrafo F de Fisher se realizo utilizando los valores de velocidad de degradacion de cada temperatura en ambas variantes de almacenamiento (Tabla 1) y demostro que no existen diferencias significativas entre las dos formulaciones estudiadas. En el estudio se tomaron como factores la temperatura y la presencia de albumina, el primero con tres niveles y el segundo con dos. El analisis de varianza bifactorial (Tabla 2) demostro que:

    - no existe diferencias significativas entre las constantes de degradacion para cada temperatura en las dos formulaciones;

    - las constantes de degradacion son diferentes para cada temperatura, independientemente de la presencia de albumina;

    - la interaccion albumina-temperatura no ejerce efecto significativo sobre la estabilidad.

------------------------------------------------------------
Tabla 1. Valores de las constantes de la velocidad de
degradacion para las variantes de formulacion con y sin
albumina.
------------------------------------------------------------
Temperaturas       1/T     k (variante I)    k (variante II)
-------------
(C)      (K)               
------------------------------------------------------------
28       301     0,00332     -0,01542          -0,01653
45       318     0,00314     -0,08274          -0,15279
55       328     0,00304     -0,77950          -1,12040

k: constantes de la velocidad de degradacion expresado en
dias^-1
variante I: sin albumina
variante II: con albumina

------------------------------------------------------------ 
Tabla 2. Analisis estadistico bifactorial realizado
mediante un test de Anova.
Este analisis se llevo a cabo empleando la F de Fisher.
------------------------------------------------------------
Fuente             Suma      GL     CM        F        F 
de variacion  de cuadrados                          tabulada
     
Temperatura     2,650911     2    1,3254   18,821     5,143
Albumina        0,33624      1    0,33624   4,7745    5,987
Interaccion     0,585414     2    0,2927    4,1564    5,143
Error           0,422536     6    0,0704      -        -
Total           3,9951      11      -         -        -
------------------------------------------------------------
Suma de cuadrados = Sigma (Y[ijk])^2     
GL: grados de libertad
                      Suma de cuadrados
CM: cuadrado medio:  -------------------  
                            GL
                            CM de cada fuente de variacion
F: estadigrafo de Fisher: ----------------------------------   
                                  CM del error
------------------------------------------------------------

Para el analisis de la estabilidad bajo condiciones reales de almacenamiento (4, -20 y -70 C) se utilizaron los valores reportados por actividad biologica (Tabla 3). Estos valores fueron analizados estadisticamente por analisis de varianza (Tabla 4) y se demostro que a pesar de las variaciones propias del ensayo de actividad biologica la degradacion en el tiempo no es significativa.

------------------------------------------------------------
Tabla 3. Valores de actividad biologica correspondientes a
las muestras almacenadas a 4, -20 y -70 C en presencia y
ausencia de albumina.
------------------------------------------------------------
             Actividad biologica inicial: 10,8 x 10^6 UI/mL
------------------------------------------------------------
Tiempo       4 C              -20 C             -70 C
       ---------------   ---------------   -----------------
(meses)  SA      CA        SA       CA        SA       CA
------------------------------------------------------------
1       2,41    3,16      6,39     8,27      5,04     4,91
2       3,28    3,95      2,76     2,56      3,57     5,69
3      12,24   11,22     12,60     9,00     12,90    16,50
9       3,20    4,52      2,26     2,26      3,26     3,26
12      9,40    6,40      7,40     9,90      7,30     8,00
17      5,48    5,91      4,05     5,74      6,32     5,21
29      6,77    7,36      6,38     7,13      7,18     5,70

Act. B: actividad biologica determinada por ensayo de
titulacion (funcion antiviral del IFN alfa) expresado en
UI/mL.
SA: sin albumina
CA: con albumina
------------------------------------------------------------ 
 
Tabla 4. Analisis de varianza de los valores de actividad
biologica reportados en la tabla 3.
------------------------------------------------------------
4 C sin      Suma       GL     CM       F     Significacion
albumina  de cuadrado                              de F
         ---------------------------------------------------
Regresion    0,2675     1     0,267   0,0162     0,9027
Residuos    98,8898     6    16,481     -           -
Total       99,1573     7      -        -           -
------------------------------------------------------------ 
4 C con      Suma      GL      CM       F     Significacion
albumina  de cuadrado                              de F
          --------------------------------------------------
Regresion    0,1549     1     0,154   0,0147     0,9027
Residuos    63,0718     6    10,511     -          -
Total       63,2268     7       -       -          -
------------------------------------------------------------ 
-20 C sin     Suma      GL     CM       F    Significacion
albumina  de cuadrado                              de F
          --------------------------------------------------
Regresion    6,5053     1     6,505   0,4438     0,5300
Residuos    87,9476     6    14,857     -          -
Total       94,4533     7       -       -          -
------------------------------------------------------------ 
-20 C con     Suma      GL     CM       F    Significacion
albumina  de cuadrado                            de F
          --------------------------------------------------
Regresion    0,8206     1    0,820    0,0689     0,8016
Residuos    71,4134     6   11,902      -          -
Total       72,2341     7      -        -          -
------------------------------------------------------------ 
-70 C sin     Suma      GL     CM       F     Significacion
albumina  de cuadrado                             de F
          --------------------------------------------------
Regresion    1,3581     1    1,358    0,1043     0,7575
Residuos    78,0536     6   13,008      -          -
Total       79,4117     7      -        -          -
------------------------------------------------------------ 
-70 C con     Suma      GL     CM       F     Significacion
albumina  de cuadrado                             de F
          --------------------------------------------------
Regresion   15,1344     1    15,134   0,8004     0,4054
Residuos   113,4508     6    18,909     -          -
Total      125,5852     7      -        -          -
------------------------------------------------------------
Suma de cuadrados = Sigma (Y[ijk])^2
GL: grados de libertad     
                       Suma de cuadrados
CM: cuadrado medio: ------------------------    
                             GL
                            CM de cada fuente de variacion
F: estadigrafo de Fisher: ----------------------------------   
                                  CM del error
------------------------------------------------------------

En la electroforesis (SDS-PAGE) no se observaron bandas de degradacion en ambas formulaciones hasta 29 meses de almacenamiento (Figura 2).

    Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS del interferon alfa humano recombinante almacenado a temperaturas de refrigeracion y congelacion durante 29 meses.
    (1) Patron de peso molecular
      a- Fosforilasa B (94000)
      b- Albumina bovina (67000)
      c- IFN alfa 2b hu-r (18000)
      d- Lisozima (12000)
    (2) Patron de trabajo de interferon alfa confeccionado en el Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia.
    (3) y (4) IFN alfa 2b hu-r almacenado a 4 C sin y con albumina
    (5) y (6) IFN alfa 2b hu-r almacenado a -20 C sin y con albumina
    (7) y (8) IFN alfa 2b hu-r almacenado a -70 C sin y con albumina
    (A) Albumina humana

El analisis del IFN alfa 2b hu-r mediante cromatografia liquida de alta resolucion en fase reversa (RP-HPLC) mostro dos especies principales, un pico mayoritario que corresponde a la molecula intacta y otro minoritario del IFN alfa 2b hu-r acetilado (17).

En los perfiles cromatograficos de los materiales almacenados a 4 C por 16 meses se observo un cambio en el pico que corresponde al IFN alfa 2b hu-r acetilado (Figura 3) que se mantiene a los 28 meses. A diferencia de este resultado en las muestras almacenadas en condiciones de congelacion (-20 y -70 C), el perfil cromatografico se mantuvo invariable hasta los 28 meses de almacenamiento (Figura 4), sin embargo se detecto la formacion de una nueva especie menos hidrofobica que la especie principal (con menor tiempo de retencion). Esta nueva especie aparecio tanto en el IFN alfa 2b hu-r almacenado a -20 C como almacenado a -70 C.

    Figura 3. IFN alfa 2b hu-r almacenado a 4 C. (A) cambios estructurales a nivel de IFN acstilado. (B) hombro que aparece entre el pico principal y el acetilado.

    Figura 4. IFN alfa 2b hu-r almacenado a -70 C. (A) nueva especie menos hidrofobica y que antecede al pico principal con menor tiempo de retencion.

La aparicion de esta nueva especie puede ser debido a transformaciones ocurridas en los residuos aminoacidicos con caracteristicas hidrofobicas lo cual conllevo a una disminucion de la hidrofobicidad de la molecula como tal. No obstante, la actividad biologica del IFN alfa 2b hu-r no se afecto, probablemente debido a que no ocurrieron transformaciones en los residuos de cisteina que intervienen en la formacion del puente disulfuro el cual esta involucrado en la funcion biologica de la molecula.

Conclusiones

El IFN alfa 2b hu-r en solucion de fosfato de sodio debe ser conservado preferiblemente en condiciones de congelacion (-20 o -70 C) por un tiempo no mayor de un ano, tiempo en el cual no ocurren cambios estructurales que modifican el perfil cromatografico de la molecula en cuestion. No obstante ello se predice por el metodo de almacenamiento acelerado que no ocurriran alteraciones que impidan el reconocimiento del IFN alfa 2b hu-r en el ensayo ELISA hasta alrededor de cinco anos almacenado a las temperaturas de -20 o -70 C. Si se almacena a 4 C la perdida del 10 % puede ocurrir al cabo del ano aproximadamente. Esto se corroboro por almacenamiento en tiempo real monitoreado por cromatografia donde se observo que al ano a 4 C, aparecen nuevas estructuras que pueden interferir en el reconocimiento inmunologico de la molecula por sus anticuerpos especificos. Ademas con estos resultados se reafirmo la importancia de utilizar otros metodos para monitorear la estabilidad de un producto biologico.

En cuanto al IFN alfa 2b hu-r, por los resultados obtenidos, no se observo propiedades estabilizantes de la albumina al menos cuando se encuentra en tampon fosfato 0,1M, pH 7,0 y bajo condiciones aceleradas de almacenamiento.

Referencias

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Recibido en abril de 1995. Aceptado en junio de 1996.

Copyright 1996 Elfos Scientiae

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