Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 3, 1996, pp. 195-196

METODOLOGIA PARA EL PROCESAMIENTO DE TEJIDO VEGETAL EN MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISION

Odelsa Ancheta, Maria Elena Ramos, Maria Cristina de la Rosa y Sandra Rodriguez

Laboratorio de Microscopia Electronica. Centro Nacional de Investigaciones Cientificas.
Ave. 25 y 158, Cubanacan, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.

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A modified method for processing plant tissue is proposed. The main changes are in the prefixation, infiltration and embedding steps, using low vacuum in the first one and a resin with low viscosity for the others. This method allows us to obtain good results and a high percentage of repetitiveness.

Key words: low viscosity, repetitiveness, low vacuum, embedding

Resumen

Se propone una metodologia para el estudio del tejido vegetal, donde se introducen modificaciones fundamentales a las tecnicas utilizadas anteriormente. Estas modificaciones consisten en el uso de bajo vacio en el paso de prefijacion y en el uso de resina de baja viscosidad en los pasos de infiltracion y de inclusion. Esta metodologia permite lograr resultados de calidad satisfactoria con una alta repetibilidad.

Palabras claves: baja viscosidad, repetibilidad, bajo vacio, inclusion

Introduccion

El estudio de las celulas de los vegetales ha tenido un avance lento, debido a las dificultades tecnicas para su procesamiento, dadas las caracteristicas de estos tejidos de ser duros, rigidos y poseer a nivel celular la pared de celulosa, la cual es una barrera para la penetracion de los distintos reactivos que se utilizan.

Se estudiaron diferentes tejidos vegetales, como hojas de tabaco y tomate, utilizando los metodos conocidos de inclusion en resina Epon 1). Mediante el procesamiento de rutina los resultados fueron de muy baja calidad. Posteriormente para estudiar hojas de cana de azucar se utilizo una combinacion de resinas Araldita mas Epon( (2) y con este metodo se obtuvieron mejores resultados, pero fue muy dificil lograr repetibilidad.

Dadas estas circunstancias, hubo necesidad de desarrollar metodos de estudio de tejidos vegetales para microscopia electronica de transmision que nos permitieran obtener mejores resultados que los logrados hasta el momento. Para ello se modificaron los metodos de fijacion y se introdujo la utilizacion de una resina de inclusion de baja viscosidad.

Materiales y Metodos

Metodologia

El metodo se basa en lograr una buena penetracion de las diferentes sustancias que se emplean en el procesamiento de tejidos duros con la utilizacion de bajo vacio en la prefijacion y resinas de baja viscosidad en la infiltracion e inclusion.

Todos los pasos de la metodologia se realizaron en un local con temperatura de 20 a 22 C y humedad relativa de 70 a 80 %. La temperatura de la estufa de polimerizacion fue de 70 C. Se utilizo la resina Spurr (3) por ser de baja viscosidad y penetrar con mayor facilidad en los tejidos vegetales. En el prospecto que trae el kit de resina se describen tres variantes de utilizacion. Recomendamos para estos tejidos la variante standard.

Procedimiento

La muestra se proceso recien obtenida. Si fue transportada desde lugares distantes se conservo en atmosfera humeda, lo que se logro colocando el material en una placa Petri con papel de filtro embebido en agua o envueltas en papel de filtro humedo y colocadas en un sobre de nylon.

Corte de la muestra

El corte se realizo en la zona afectada, la cual se selecciono con una cuchilla o bisturi bien afilado. El corte se hizo lo mas pequeno que el tejido especifico permitio.

Prefijacion

Las muestras se colocaron en frascos pequenos con 3 mL de la solucion prefijadora (glutaraldehido al 5 % en tampon cacodilato 0,1 M, pH 7,4) y se introdujeron los frasquitos destapados en una desecadora a la que se le hizo bajo vacio durante los primeros 30 min. Despues se guardo la desecadora en refrigeracion (4 C) y se conservo el vacio durante una noche (14-18 h).

Lavado

Se lavaron las muestras varias veces en tampon cacodilato 0,1 M, pH 7,4 por espacio de 8 h. (En este paso se puede dejar toda la noche a 4 C).

Fijacion

Las muestras se posfijaron en tetroxido de osmio (OsO4) al 1 % en tampon cacodilato 0,1 M, pH 7,4 durante una noche (14-18 h).

Lavado

Se hicieron lavados cortos con el mismo tampon por espacio de 30 min.

Deshidratacion

Se uso preferentemente acetona como agente deshidratante, ya que es mas energico que los alcoholes. La deshidratacion se hizo de forma escalonada, comenzando por acetona al 10 % y se va aumentando la concentracion de acetona en pasos sucesivos de deshidratacion (incrementos de 10 % en cada paso) hasta llegar a acetona absoluta.

El tiempo fue de 15 min en cada paso y en acetona absoluta 2 h con cambios cada 30 min.

La temperatura es 4 C hasta acetona al 90 % y en acetona absoluta a temperatura ambiente.

Infiltracion

La infiltracion se realizo a temperatura ambiente. Se comenzo con una mezcla de una parte de resina y tres partes de acetona durante 1,5 h, se cambio a una mezcla de resina y acetona a partes iguales durante 1,5 h. Posteriormente se paso a una mezcla de tres partes de resina y una de acetona durante una noche.

Al dia siguiente se sustituyo esta mezcla por resina pura y se dejo en ella durante una noche.

Inclusion

La orientacion de la muestra en las capsulas de inclusion se hizo de acuerdo con el tejido o la zona del tejido objeto de estudio.

Se anadio a las capsulas la resina de inclusion y se colocaron en la estufa a 70 C durante 24 h para su polimerizacion.

Resultados y Discusion

La ultraestructura del tejido vegetal se observo con nitidez y con un alto por ciento de buena conservacion, lo cual no ocurre con los metodos utilizados con anterioridad a esta metodologia (Figura 1).

Figura 1. Muestra de hoja de cana de azucar procesada con el metodo de Mollenhauer. Se observa poco definidos los componentes celulares; p) pared; m) mitocondrias; t) tonoplastos y en) envoltura nuclear. 11 000 X.

Figura 2. Muestra de hoja de cana de azucar procesada por la metodologia propuesta. Se observa buena conser- vacion del tejido y definicion de los componentes celulares; p) pared; m) mitocondrias; c) cloroplastos; n, nu) nucleo y nucleolo y rer) reticulo endoplasmico rugoso. 9 000 X .

Figure 3. Muestra de hoja de citricos. Se observa con muy buena definicion los componentes celulares; n) nucleo; m) mitocondrias y rer) reticulo endoplasmico rugoso. La pared celular (p) presenta su estructura caracteristica. 15 000

Referencias

1 Luft JH. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol 1961;9:409.

2 Mollenhauer HH. Plastic embedding mixtures for use in electron microscopy. Stain Technol 1964;39:111.

3 Spurr AR. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastruct Res 1969;26:31.

4 Diaz E, Maribona R, Korneva S, Ancheta O. Osmotic behaviour of protoplasts of sugar cane. Presentado en Biotecnologia Habana'92 C. Habana, Cuba 1992.

5 Garcia Maria E, Rodriguez S, Ramos Maria E. Caracteristicas ultraestructurales del grano de polen en dos variedades de tomate (Lycopersicon esculentum Mill). Presentado en: IV Simposio de Botanica. C. Habana, Cuba 1993.

6 Mondejar C, Rodriguez S, Ancheta O. Ultraestructura de la embriogenesis somatica en cana de azucar. Tesis de Diploma. Facultad de Biologia, Universidad de la Habana 1993.

7 Zavaro C, Rodriguez S, Ramos Maria E, de la Rosa Maria C, Barreto A. Estudio de una teratologia en los frutos de Fimbristylis dichotoma (L) Vahl (Cyperaceae) Fontqueria 1993;36:273.

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