Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 3, 1996, pp. 202-203

ESTRATEGIA DE ESCALADO PARA LA PRODUCCION DE LA ENZIMA RECOMBINANTE alfa-AMILASA

Mario Canales, Eduardo Ramos y Antonio Enriquez

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado Postal 6162, C.P. 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

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La enzima alfa amilasa ha sido expresada eficientemente en la levadura Pichia pastoris (1, 2). En nuestro Centro se ha desarrollado una tecnologia para su obtencion (3). En este trabajo se expone la estrategia seguida en el escalado de la produccion y la secuencia de procesos scale up /scale down realizada para llegar a un esquema productivo economicamente factible.

Materiales y Metodos

Cepa

Se utilizo la cepa MPA 3625 en la cual fue clonado el gen que expresa la enzima alfa-amilasa recombinante.

Medios de cultivo

Para la etapa de propagacion se utilizo un medio salino suplementado, con glucosa como fuente de carbono. Durante la etapa de produccion se utilizo un medio que contiene sales de amonio, urea y miel final de cana, hasta una concentracion de azucares reductores de 60 g/L como fuente de carbono. La expresion se indujo por adicion de metanol.

Determinaciones de azucares reductores

Fueron realizadas utilizando el metodo descrito por Miller (4).

Determinaciones de actividad enzimatica

Se utilizo el mismo metodo empleado por Margolles, et al. (1).

Recobrado de la enzima

Los procesos de cosecha de biomasa se efectuaron en centrifugas de pomos a 10 300 x g a pequena escala y en centrifugas de discos a 10 600 x g para la escala piloto. La filtracion se realizo en un filtro prensa de 0,8 m^2 de superficie filtrante y la concentracion en un rotoevaporador al vacio a 50 C.

Resultados y Discusion

Se optimizo un esquema de fermentacion en 5 L de volumen efectivo, que fue escalado hasta 200 L, en el que se logro obtener 1 000 uAE/mL (2,1 g/L de enzima) en 80 h de fermentacion, con una productividad de 12,5 uAE/L h y un consumo de metanol de 1,82 mL/L de cultivo. Se diseno a partir de los resultados una secuencia de pasos de recobrado de la enzima que incluyeron: la separacion de la biomasa por centrifugacion, la filtracion del crudo enzimatico y su concentracion en un rotoevaporador al vacio. Se establecieron las operaciones en planta piloto y se obtuvieron los indices fundamentales de perdidas de cada operacion que permitieron disenar y evaluar economicamente la tecnologia propuesta a diferentes capacidades.

Figure 1. Costo de produccion, ganancia economica y plazo de recuperacion de la inversion contra capacidid de produccion para la technologia inicial.

Costo de produccion ($/ano), Ganancia ($/ano), Plazo de recuperacion de la inversion (anos)

La Figura 1 muestra la influencia que sobre el costo de produccion y el plazo de recuperacion de la inversion tiene la capacidad de produccion elegida. Para capacidades inferiores a 5 000 t/ano, el costo de produccion es mayor que la ganancia, para un precio estimado de la enzima de 3 000 $/t. Como consecuencia los plazos de recuperacion de la inversion son superiores a los 4 anos, aumentando hasta 17 cuando la capacidad disminuye a 1 000 t anuales.

Del estudio de la demanda en nuestro pais se estimo una capacidad necesaria para la planta entre 1 000 y 2 000 t anuales. Se analizo la tecnologia propuesta y se concluyo que el proceso limitante era la fermentacion, y que por ello el porciento de utilizacion del equipamiento de recobrado era bajo. Se hizo un scale down del proceso fermentativo y se desarrollo un esquema de fermentacion semicontinua en el que se redujo el tiempo de fermentacion a 40 h, con el mismo nivel de expresion de la proteina. (Figura 2). A partir de este resultado una nueva evaluacion de la tecnologia para una planta de 2 000 t/ano mostro plazos de recuperacion de la inversion de 3 anos.

Figure 2. Proceso de fermentacion semicontinuo, en el que disminuyo el tiempo de fermentacion a 40 h.

1 Margolles E, et al. Biotecnologia Aplicada 1992;9:38- 47.

2 Paifer E, et al. Yeast 1994;10:1415-1419.

3 Chico E. Trabajo de Diploma 1992.

4 Miller GL. Use of dinitrosalicilic acid for determination of reducing sugar. Anal Chem 1959;31:426-428.

Copyright 1996 Elfos Scientiae

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