Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 3, 1996, pp. 207

Establecimiento de un proceso para la obtencion de proteina a, partiendo de una cepa de Escherichia coli recombinante

Jose E Brito, Nuria Reyes, Gabriel J Marquez, Yurkins Tejero, Enrique Perez, Giovany Reyes, Alain Martinez, Diamile Gonzalez, Raysa Vazquez, Jorge Sotolongo, Maria Lourdes Villalonga, Edurnes Marquetti, Luis Trujillo, Ernesto Gonzalez, Iren Garcia, Omar Garcia, Enrique Duranh y Sergio Perez

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado Postal 6162, C.P. 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. Telefono:(53-7) 21-84-66.

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La proteina A de Staphyloccocus aureus (SPA), es una herramienta muy usada en un gran numero de tecnicas inmunologicas y de diagnostico. Es utilizada en la purificacion de anticuerpos mediante cromatografia de afinidad (1), la interaccion SPA-IgG es destruida por disminucion del pH o por el uso de agentes caotropicos como el KSCN (2).

A partir de un clon de E. coli productor de la region de la proteina A responsable de la union a IgG, y de fermentaciones con rendimientos entre un 15 y un 25 % de la proteina total, se desarrollo un proceso productivo de dicha proteina, en el cual se obtiene un alto grado de pureza en la preparacion final, eliminandose la necesidad del uso de cromatografia de afinidad con IgG inmovilizada, la cual eleva grandemente el costo de produccion de dicha proteina.

Materiales y Metodos

La cepa de E. coli HB 101 fue utilizada como hospedero de dos plasmidos, el pPCITS utilizado para regular el promotor PR y el pPA3, portador del gen con las 5 regiones responsables de la union a IgG de la proteina A.

El cultivo es crecido en medio LB a 30 C hasta DO660 de 0,6 y posteriormente la temperatura es elevada hasta 42 C, manteniendolo en estas condiciones durante 3 h.

El proceso de purificacion desarrollado parte de 100 g de biomasa chequeada por SDS-PAGE y densitometria para un porciento de SPA no menor del 15 %. Posteriormente se realiza una ruptura a traves de Prensa Francesa y ultrasonido.

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Tabla 1. Purificacion promedio para cuatro lotes de
SPA.
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No.  Etapa      Vol. Conc.  SPA  P.tot. SPA tot.  Rend.  G.P.
               (mL) (mg/mL) (%)   (mg)    (mg)     (%) (veces)

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1 Crudo       270,0  57,4  22,9  15494,5  3564,6  100,0   1,0
2 P Pon aciia 383,8  18,1  43,3   6821,9  3135,7   90,8   2,0
3 Amonio y 
    G 25      505,3   3,9  84,2   2462,5  2083,1   63,3   3,9
4 Final 
(DEAE y conc) 205,0   9,9  96,2   1880,7  1809,2   53,2   4,4
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Las etapas de semipurificacion posteriores incluyen una precipitacion acida y precipitaciones a 2 % de sulfato de amonio (35 y 60).

En el primer paso cromatografico la muestra es sometida a un desalado mediante el uso de G-25 utilizando una columna BP 100/500, monitoreando A280 y conductividad. Posteriormente se realiza una cromatografia en DEAE-Sepharose. La elucion es en forma de gradiente lineal salino (0-0,25 M de NaCl). La preparacion final obtenida es sometida a una filtracion esterilizante y liofilizada para su almacenamiento.

Resultados

El proceso de purificacion asi desarrollado brinda un rendimiento promedio del 53 % de la proteina A total de partida, y un grado de purificacion de 4,4 veces. Los resultados mostrados constituyen el promedio de cuatro lotes consecutivos (Tabla 1).

Mediante SDS-PAGE, analisis densitometrico y Western-Blot, se demuestra que las preparaciones proteicas finales poseen un grado de pureza superior al 95 %, mostrando ademas, resultados similares a preparaciones de proteina A patrones, cuando son empleadas en tecnicas inmunologicas como la inmunodifusion radial y el Dot-Blot.

El proceso establecido brinda una preparacion final de calidad elevada, con un alto grado de pureza y apta para su uso en tecnicas inmunologicas y de diagnostico.

References

1 Hjelm H, et. al. Eur J Biochem 1975; 57:395-403.

2 Kronvall G, Seal US, Finstad J, Williams RC Jr. J Immunol 1970;104:140-147.

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