Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 4, 1996

Purificacion De La Endonucleasa De Restriccion NcoI Libre De Exonucleasas Y Endonucleasas Contaminantes

Raysa Vazquez, Duniesky Martinez, Giovany Reyes, Gabriel Marquez, Nuria Reyes, Yaquelin Diaz, Manuel Luis,

Belkis Gonzalez y Nubia Gonzalez

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado postal 6162, C.P. 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Introduccion

Las endonucleasas de restriccion son proteinas que reconocen y cortan secuencias especificas de la molecula de ADN, por lo que constituyen instrumentos indispensables y eficaces en el desarrollo de las tecnicas de ADN recombinante, permitiendo la expresion de proteinas de interes a partir de diferentes fuentes (celulas de bacteria, levaduras y organismos superiores); extendiendose su uso a estudios de secuenciacion, mapeo genetico, interaccion ADN-proteina, diagnostico prenatal de enfermedades geneticas y otros.

La endonucleasa de restriccion NcoI, procedente del microorganismo Rhodococus ruber, reconoce una secuencia hexanucleotidica palindroma en la molecula de ADN, y su secuencia de corte y sitio de reconocimiento son:

                5' ...C*CATGG... 3'
                3' ...GGTAC*C... 5'

60 g de biomasa del microorganismo Nocardia coralina se resuspenden en 120 mL de buffer A que contiene: 10 mM KH2PO4; 0,1 mM EDTA; 10 mM 2-mercaptoetanol y 0,05 mM PMSF pH= 7,5, se le anade lisozima a una concentracion final de 1mg/mL y se incuba 30 min en hielo. El lisado se rompe por dos pases de prensa francesa a 1500Kgf/cm^2 y se homogeniza con dos ciclos de ultrasonidos de 30 seg cada uno. El debris celular es separado por ultracentrifugacion a 37000rpm durante 1h. Al sobrenadante se le anade NaCL a una concentracion final de 200 mM, y se chequea actividad enzimatica incubando diferentes unidades con 1 ug de lamda ADN en buffer de reaccion: 20 mM Tris-acetato, 10 mM Acetato de magnesio, 50 mM Acetato de potasio y 1 mM de DTT a pH= 7,9. Los acidos nucleicos son separados anadiendo una solucion de PEI al 1% de concentracion final seguido por la precipitacion de proteinas con diferentes cortes de amonio, al 25% y al 50% donde precipita nuestra proteina de interes.

La muestra es aplicada a una resina intercamdiador anionico (DE52). Las proteinas no absorbidas se lavan con 400 mL del buffer A. Se eluyen las proteinas adsorbidas seguidas de un gradiente lineal de sales. Las fracciones con actividad enzimatica son detectadas haciendo diluciones 1/5 de cada fraccion, detectando contaminacion con nucleasas inespecificas empleando incubacion con pGB90 y lamda ADN. Las fracciones que no degraden ni transformen el material comparadas con el control negativo se precipitan al 70% de saturacion con (NH4)2SO4. Se desalinizan usando una columna PD10 (G-25) y el eluato se aplica a una columna intercambiador cationico (P11). Las fracciones con actividad hasta 1/5 se chequean para detectar contaminacion con nucleasas inespecificas comparandolas con un control negativo. Las fracciones finales se unen y se concentran contra el buffer de almacenamiento que contiene 10 mM Tris-HCl; 0,1 mM EDTA; 50 mMKCl; 1 mM DTT y BSA acetilada libre de nucleasas 200 ug/mL.

Resultados y Discusion

En la Figura 1 se muestra el porcentaje de ruptura celular alcanzado convinando diferentes metodos. El valor logrado con la lisozima es de un 7%, la accion de la prensa francesa tiene gran importancia, en el primer pase la eficiencia de ruptura es de 26%, y con el segundo de 51%, siendo este el metodo mas efectivo para la ruptura celular. Estos resultados demuestran la efectividad del proceso de disrupcion utilizado.

Figura 1

Con este protocolo se establecio la purificacion de dicha enzima, obteniendose muy buenos resultados. La precipitacion de acidos nucleicos y posteriormente la precipitacion de proteinas brindan un buen aporte a la purificacion quitando gran cantidad de trazas de proteinas contaminantes las cuales no interfieren posteriormente en la cromatogafia de alta resolucion. Como se puede observar en la Tabla 1 se obtiene un grado de purificacion final de 118 veces, con una actividad especifica de 16 304 U/mg y un rendimiento del 14%. Se obtuvo una preparacion final con una actividad de 15 U/æL, libre de endonucleasas (mas de 120 pores de sobredigestion) y libre de exonucleasas inespecificas.

Tabla 1.

                Act.tot. Prot.tot Act.esp. Rendim. G de purif.
Etapa           (U)       (mg)    (U/mg)    (%)      (veces)
--------------------------------------------------------------
Ext. crudo      550 000  4 028,0   136      100,0     1,0
(NH4)2SO4 (50%) 440 000    711,5   619       85,2     4,6
DE -52          130 000     66,0  1 970      40,3    14,6
Ccnc.y desalado 100 000     38,2 2597,4      31,0    19,09
Bio-Rex 70       75 000      4,6 16 304      14,0    118,6

References

1. Brooks J. Properties and uses of restriction endonucleases, Methods in Enzimology,152, Beyer and Kimmel, Academic Press Inc., USA 1987.

2. Harris E, Angel S. Protein purification methods a practical approach 1992;87-90.

3. Roberts R. Restriction enzymes and their Isochizomers. Nucleic Acids Research 17 Suplement 1989;347-387.

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