Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 13, Num. 4, 1996

Diferentes Estrategias De Adicion Del Sustrato A Los Cultivos De Pichia pastoris Recombinante

Efrain Rodriguez Jimenez, Kosara Sanchez, Hernan Roca y Julio Delgado

Division de Bioindustria, CIGB, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Introduccion

La industria azucarera no se ubica entre las ocho primeras en la aplicacion de las enzimas industriales (1), debido fundamentalmente al elevado precio de las enzimas aplicables en ella motivado por sus altos costos de produccion. El uso de las tecnicas de recombinacion, asi como la aplicacion de las tecnologias y sistemas de fermentacion bien ajustados, disminuyen considerablemente los costos y facilitan obtener procesos de alto rendimiento (2-5). En este trabajo se muestra la influencia que ejerce la estrategia utilizada de adicion del sustrato inductor sobre el crecimiento celular y la secrecion de la enzima recombinante dextranasa, donde los maximos alcanzados fueron de 320 y 5 g/L de cultivo, respectivamente.

Parte experimental

Para el estudio se utilizo la cepa de Pichia pastoris recombinante con el gen que codifica para la dextranasa. Se trabajo en medio industrial que contiene 10 mM de (NH4)2HPO4, 6,8 mM de (NH4)2SO4, 8,3 mM de Urea y agua amoniacal 25 % como titrante. La fuente de carbono inicial en los cultivos y para los inoculos fue 4 % de reductores libres aportados por la miel final de cana clarificada. Las fermentaciones se realizaron a escala de 1,5 L con 1 vvm, 350 rpm, a pH inicial de 5,5 y 30 C. Al agotarse los reductores libre, el pH se fijo a 5,2, se incremento la agitacion a 750 rpm y se adiciono 1 % de MeOH. Al aparecer la respuesta metabolica del cultivo al nuevo sustrato, se comenzo la dosificacion de 2 g de MeOH/Lh. Se analizaron tres estrategias de variacion del flujo de adicion de MeOH en la segunda fase (de produccion).

a. El flujo del MeOH se incremento en 0,5 g/Lh por cada 50 g de incremento ocurrido en la biomasa humeda del cultivo.

b. El flujo de incremento se siguio por el factor Ki, donde f(MeOH) = BH/ Ki.

c. El flujo de MeOH se aumento en funcion del oxigeno disuelto de forma tal que la tendencia de este fuera a disminuir y se mantuviera entre 15 y 20 %.

Resultados y Discusion

Como se puede apreciar en la Figura 1, en el caso (a), el crecimiento en metanol mantuvo un comportamiento estable, con una u promedio de 0,013 h^-1 pero la secrecion de enzima solo mostro aumentos considerables, inmediatamente despues de cada incremento del flujo. En el caso (b) sin embargo, la u en intervalos tomo valores proximos a 0,03 h^-1 apareada a una alta secrecion de la enzima, pero cuando el flujo de incremento llego a 4,3 g/Lh, ambas se inhibieron debido a la toxicidad del metanol y a la incapacidad para ser degradado este a la concentracion alcanzada por la acumulacion. Finalmente, en el caso (c), el comportamiento del crecimiento fue estable, con una u de 0,016 h^-1 al igual que el de la secrecion enzimatica, la cual llego a alcanzar el valor extraordinario de 5 g/L. En la Tabla 1 se aprecian algunos datos sobre el rendimiento de estos cultivos.

Figura 1. Curvas de crecimiento y secrecion de enzima: (a-c) en correspondencia con la estrategia utilizada.

Tabla 1. Algunos indicadores de los cultivos (a-c) en correspondencia con la estrategia utilizada.

Indicadores de rendimiento              (a)    (b)    (c)
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Biomasa humeda/sustrato (g BH/g MeOH)  0,739  0,469  0,889
Producto/sustrato (UAE x 10^3/g MeOH  10,27   4,95  12,66

1. EA Falch. Industrial Enzymes-Developements in Production and Application. Biotechnology Advances 1991;9(4):643-658.

2. Modak JM and Lim HC. Simple Nonsingular Control Approach to Fed Batch Fermentation Optimization. Biotechnology and Bioengineering 1989;33:11-15.

3. Agrawal P, Koshy G and Ramseier M. An Algorithm for Operating a Fed Batch Fermentor at Optimun Specific-Growth Rate. Biotechnology and Bioengineering 1989;33:115-125.

4. Suarez-Cortez R, lvarez-Gallegos J and Gonzalez-Mora. E Sliding Controller Design for a Nonlinear Fermentation System. Biotechnology and Bioengineering 1989;33:377-385.

5. Andrews G. Estimating Cell and Product Yields. Biotechnology and Bioengineering 1989;33:256-265.

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