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DISENO Y CONSTRUCCION DE UN SECUENCIADOR DE PROTE NAS AUTOMATICO Y COMPACTO, A PARTIR DE ELEMENTOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE
Jose M Cruz^1, *Vivian Huerta^2, Vivian Morera^2, Sergio Lopez^1, Rolando del Rey^1, Jesus Randulfe^1, Alicia Rodriguez-Maribona^1, Elio Doncel^1, Irene Niubo^1 y Nelson Menendez^1
^1 Instituto Central de Investigaciones Digitales (ICID) P.O. Box 16055,
Habana. Recibido en julio 1996. Aprobado en diciembre 1996.
Code Number:BA97004
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ABSTRACT We describe a protein sequencer, built-in with commercially available elements. It uses zero dead-volume membrane valves and a cross-flow- reactor. Solvents and reagents path lengths are minimal. As a consequence, the consumption of reagents is low. Miniature valves are used to control vacuum and inert gas supply. Sequencer and the chromatographic system are controlled by an IBM-compatible personal computer. A software was developed that offers several operational facilities, allows the acquisition of the absorbance signal and the chromatograms processing. The system can control either analogue or RS232 high performance liquid chromatography pumps. Sample amounts around 10 pmol can be sequenced with an initial yield of 57- 74 %, a repetitive yield of 94-98 % and low background signals in chromatograms (<1 pmol). Key words: PTH-amino acids, repetitive yield, automatic sequencing RESUMEN Se describe un secuenciador de proteinas, construido a partir de elementos comercialmente disponibles. En el se utilizan valvulas de membrana de cero volumen muerto; las trayectorias de los reactivos y solventes es minima y se usa una camara de reaccion de flujo transversal. Todo ello contribuye al bajo consumo de reactivos. Se emplean valvulas miniaturizadas para el control del gas inerte y del vacio. El secuenciador y el sistema cromatografico son controlados a traves de una computadora personal IBM- compatible. Se desarrollo un programa que brinda numerosas facilidades de operacion, permite la adquisicion de la senal de absorbancia y el procesamiento de los cromatogramas. El sistema puede manejar bombas de control analogico o por comunicacion serie RS232. Permite secuenciar en el rango de 10 pmol de muestra con un rendimiento inicial de 57-74 %, un rendimiento repetitivo de 94-98 % y bajos niveles de fondo en los cromatogramas (<1 pmol). Palabras claves: PTH-aminoacidos, rendimiento repetitivo, secuenciacion automatica Introduccion A partir de la introduccion del primer secuenciador automatico descrito por Edman y Begg (1) en 1967, en el que acunaron el termino "sequenator", se comenzo a comercializar instrumentos cada vez mas eficientes para esta funcion, los que han sido descritos en la literatura (1-5). El objetivo ha sido secuenciar cantidades de proteinas cada vez menores y obtener secuencias cada vez mas largas y confiables. Debido al alto costo de los reactivos y solventes necesarios, se ha tratado de utilizar la menor cantidad posible de estos. Los avances fundamentales en el desarrollo de estos instrumentos despues de la introduccion del secuenciador de fase gaseosa (2) se deben al perfeccionamiento de los materiales utilizados, a las mejoras en los sistemas de deteccion de los derivados de feniltiohidantoina (PTH) de los aminoacidos y a los avances en el control automatico y la computacion de los datos.
En Cuba, el continuo desarrollo de la biotecnologia ha generado la necesidad creciente del analisis de secuencias de proteinas. Con este trabajo nos propusimos disenar y construir un secuenciador automatico a partir de elementos comercialmente disponibles, dado el alto costo de los equipos comerciales (> 150 000 USD) y nuestras dificultades para adquirirlos en el mercado internacional. Adicionalmente fue necesario desarrollar un programa que nos permitiera controlar el secuenciador, el sistema cromatografico y la adquisicion y el procesamiento de los datos de absorbancia desde una computadora. Materiales y Metodos Sistema de cromatografia liquida de alta eficacia y separacion de los PTH-aminoacidos El secuenciador y su programa fueron concebidos de modo que pudieran utilizarse bombas de cromatografia liquida de alta eficacia (HPLC) de control analogico o por comunicacion serie RS232.
Los resultados presentados en este trabajo se obtuvieron con un modulo de gradiente para HPLC (Knauer). Incluye un desgasificador de vacio de conexion en linea, dos bombas modelo 64 con microcabezales, una camara de mezclado dinamico, un horno compacto MII, un espectrofotometro a 269 nm con celda de flujo de paso optico de 10 mm y una valvula de inyeccion electrica tipo AA. El programa de gradiente envia los datos al convertidor digital/analogico que controla las bombas una vez por segundo.
La separacion de los PTH-aminoacidos se llevo a cabo a una temperatura de 55 C y a un flujo de 280 uL/min. Se utilizo una columna de fase inversa RP 18 de 5 um (2 x 250 mm) (Knauer). Como solucion tampon A se utilizo 3,5 % de tetrahidrofurano (THF), grado HPLC (Rathburn) en agua Milli Q, 2,5 mM de 1-octanosulfonato de sodio 98 % (Aldrich), 0,025 % de acido acetico glacial 100 % (Merck). Se ajusto la separacion de los PTH-aminoacidos utilizando soluciones tampones de acetato de sodio 3 M (1:1, pH 3,8: pH 4,6), grado HPLC (Knauer). Como solucion tampon B se utilizo acetonitrilo, grado HPLC (Merck). El gradiente utilizado fue: 3 min a 11 % de B, a los 10 min 29 % de B, a los 15 min 37 % de B hasta los 20 min, a los 22 min 47 % de B hasta los 26 min, a los 27 min 80 % de B hasta los 30 min. Reactivos y solventes para la secuenciacion Estandar de PTH-aminoacidos (Pierce), difluoruro de polividileno (PVDF) (Millipore).
Todos los reactivos y solventes utilizados en el secuenciador se adquirieron comercialmente (grado secuencia) de la firma Knauer. Los reactivos utilizados fueron los siguientes: como reactivo de acoplamiento, una solucion al 5 % de fenilisotiocianato (PITC) en n-heptano y como base para ajustar el pH del acoplamiento, una solucion al 6 % de trimetilamina (TMA) en una mezcla 1:1 (v/v) de metanol y agua. Para la ruptura se utilizo acido trifluoroacetico (TFA) anhidro y para la conversion una solucion del mismo al 25 % en agua.
Los solventes usados para el lavado despues del acoplamiento y para el traslado del derivado de anilinotiazolinona (ATZ) del aminoacido hacia el convertidor fueron acetato de etilo y cloruro de butilo. El solvente de lavado del convertidor fue metanol. Para disolver los PTH-aminoacidos e inyectarlos al HPLC se utilizo una solucion de acetonitrilo al 20 % en acetato de sodio 75 mM. Proteinas y peptidos La proteina estandar fue la -lactoglobulina b (Knauer), grado secuencia. Los peptidos St1 y St2 se obtuvieron por hidrolisis con bromuro de cianogeno de la proteina Sthicolisina II (6). Programa de degradacion (Tabla 1)
--------------------------------------------------------------------------- Tabla 1. Resumen elaborado por bloques de pasos del programa de secuencia. Como los eventos son simultaneos cada bloque se nombra con la entrega de reactivo o solvente que ocurre. --------------------------------------------------------------------------- Paso Funcion Tiempo (s) Volumen (uL) --------------------------------------------------------------------------- R2 Entrega de R2 al reactor 27 6 Dry2 Secado de la membrana 82 R1 Entrega de R1 al reactor 36 12 R2 Entrega de R2 al reactor 27 6 B2 Lavado del bloque de membranas con S2 18 18 D4 Decp 2 CPL2* Reaccion de acoplamiento 1542 S2 Lavado del reactor con S2 54 18 R3** Entrega de R3 al reactor 12 6 B3** Lavado del bloque de membranas con S2 27 18 S3** Entrega de S3 al convertidor 122 100 S4** Lavado del convertidor con metanol 71 300 D4** Secado del convertidor 22 R4** Entrega de R4 al convertidor 41 50 Dry3 Evaporacion de R3 en el reactor 32 S1 Traslado del ATZ hacia el convertidor 78 200 Total 2193 * El tiempo del acoplamiento es de 25 min y 42 s. **El tiempo de ruptura es de 4 min y 55 s. El tiempo total del ciclo es de 36 min y 33 s. Temperatura del reactor 45 §C. Temperatura del convertidor 50 §C. R1: PITC en n-heptano, R2: TMA 6 % en agua:metanol 50 %, R3: TFA anhidro, R4: TFA 25 % en agua, S1: cloruro de butilo, S2: acetato de etilo, S3: acetonitrilo 20 % en acetato de sodio 75 mM, S4: metanol. --------------------------------------------------------------------------- Aplicacion de la muestra Como soporte de la muestra se utilizo una pieza de forma eliptica de de 12 x 5 mm.
La aplicacion de las muestras en solucion se realizo activando la membrana con metanol y depositando en su centro 5 uL de la muestra disuelta en TFA 50 %. La pieza de PVDF con la muestra transferida se coloco directamente en el reactor. Calculo de los rendimientos El rendimiento inicial (RI) del equipo se calculo cuantificando la cantidad de PTH presente en el primer ciclo y corrigiendo segun el por ciento de la muestra inyectada en el HPLC. El rendimiento repetitivo (RR) se calculo mediante la expresion:
m y n: ciclos donde aparece un aminoacido dado en la secuencia (Tabla 2).
---------------------------------------------------------------------------
Tabla 2. Rendimiento repetitivo obtenido para diferentes pares de
aminoacidos en cinco corridas de 200 pmol de beta-Lactoglobulina B(B). Se
muestra ademas el rendimiento inicial para cada corrida. Todos los valores
en la tabla estan expresados en por ciento.
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Aminoacido Ciclos (n,m)* (B)Lac1 (B)Lac2 (B)Lac3 (B)Lac4 (B)Lac5
---------------------------------------------------------------------------
L 1,10 95 96 91 95 95
I 2,12 95 92 92 94 93
V 3,15 97 95 93 95 93
T 4,18 92 99 91 92 94
Q 5,13 97 99 100 95 99
K 8,14 n.d n.d 92 93 90
G 9,17 112 88 99 91 94
RR promedio 98 95 94 94 94
RI 57 67 58 74 66
*Para el calculo de los rendimientos ver Materiales y Metodos; n.d.: no
determinado.
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Resultados y Discusion Diseno del instrumento En la Figura 1 se muestra la vista frontal del instrumento y en la Figura 2 la vista posterior. El secuenciador S6000 mide 68 cm de ancho, 54 cm de profundidad y 54 cm de altura. Resulta mas pequeno que el modelo 910 Knauer (87 x 53 x 64 cm) y solo un poco mas grande que la version compacta del secuenciador de fase gaseosa desarrollada por [Calaycay et al. en 1991] (25 x 38 x 44 cm) (3). El suministro de gas se realiza desde los balones a 3 bar a traves de reguladores de alta pureza (Aldrich). Tiene una trampa indicadora de humedad R&D Separations (modelo MT400-2-S) en cascada con un filtro de particulas Balston (modelo L9933-05-AQ). El suministro de reactivos y solventes, asi como las transferencias entre el reactor, el convertidor y el sistema cromatografico se efectuan por diferencia de presion utilizando el gas a una de las presiones, 70 o 320 mbar. Para obtenerlas se usan dos reguladores de presion de precision Brooks Instruments (modelo 8601D), y se indican por medio de dos manometros situados en el panel frontal.
Las entregas de reactivos y solventes se logran presurizando (70 mbar) los frascos correspondientes y entregando durante un tiempo determinado, con excepcion de la TMA y el TFA anhidro que se dosifican por programa y del solvente de inyeccion en el sistema cromatografico y la mezcla estandar de PTH-aminoacidos que se inyectan en cantidades fijas determinadas por un lazo volumetrico. Tanto las entregas, el suministro de gas para el secado y los movimientos de los ATZ y PTH-aminoacidos entre el reactor, el convertidor y el sistema cromatografico se realizan a traves de valvulas de membrana de teflon y vidrio de cero volumen muerto tipo Wittmann-Liebold (7). La disposicion vertical de los bloques de vidrio de las valvulas brinda un mejor acceso a las mismas para las operaciones de mantenimiento que el que es posible lograr en otros secuenciadores modulares comerciales. Las conexiones entre los bloques de valvulas, los frascos de reactivos y el de desecho se realizan con tuberias de teflon o tefzel de 0,7 y 0,5 mm de diametro interno, 1,6 mm de diametro externo y de longitud minima. Las tuberias se unen a las valvulas por medio de conexiones de teflon tipo "pull-through". Como consecuencia, el consumo de reactivos y solventes es bajo.
Las valvulas de membrana son accionadas por electrovalvulas Festo (modelo MOZH3-M3) de 24 Vcd montadas sobre bloques multiples. Gracias al pequeno tamano de las electrovalvulas, estas se pudieron montar de forma que todas las conexiones con las valvulas de membrana son cortas y de la misma longitud, lo cual reporta consumos de gas y vacio reducidos con la correspondiente disminucion de los gastos de operacion y mantenimiento. El vacio se produce por una bomba con membrana de teflon (Vacuubrand, modelo MZ 2 C) y su nivel se indica por un vacuometro en el panel frontal (Figura 1).
1. Interruptor general
Figura 2. Vista posterior.
1. Conexion al lazo volumetrico
El reactor es del tipo de flujo transversal Knauer (4) con un volumen de 15-20 uL y como convertidor se utiliza un vial Pierce de fondo conico de 1 mL. La inyeccion al sistema cromatografico se realiza a traves de una valvula de seis puertos y dos posiciones con un lazo volumetrico de 50 uL. Dicha valvula es manejada electricamente por el secuenciador. La disposicion de las conexiones entre el convertidor, la linea de desechos y el sistema de HPLC responden al esquema descrito por Keith Ashman en 1986 (8). La deteccion de la condicion de lazo lleno se realiza por un detector ultrasonico construido para ese fin. La inyeccion al sistema cromatografico constituye el 50 % de la muestra presente en el convertidor. Este valor es inferior al 70 % que se considera tipico para estos equipos actualmente (9).
En el secuenciador se utiliza una fuente de alimentacion de 24 Vcd para la operacion de las electrovalvulas y la electronica interna. Esta ultima comprende: los circuitos que reciben las senales de control del nivel "transistor-transistor-logic" (TTL) de la computadora y las acondicionan para manejar las electrovalvulas; el circuito que detecta la ausencia de gas o de vacio, acciona la alarma sonora y se lo comunica a la computadora para que detenga el proceso; el circuito que controla el arranque y parada de la bomba de vacio; los acondicionadores de las senales de muestreo de las temperaturas del reactor y el convertidor y de accionamiento de los calefactores correspondientes; el detector ultrasonico de lazo lleno que controla la inyeccion y el manipulador de las bombas del sistema cromatografico si estas son de control analogico. Las bombas de control por comunicacion serie son manejadas a traves de dos puertos serie RS232 de la computadora.
Teniendo en cuenta los costos de los materiales necesarios para la construccion del equipo este resulto de cinco a seis veces mas economico que los secuenciadores comerciales, en el mismo ano (en este valor de costo no esta incluida la mano de obra calificada de la que fue necesario disponer). Por otra parte, la experiencia adquirida en este tipo de tecnologia es ventajosa economicamente ya que permite enfrentar los servicios tecnicos y de mantenimiento del equipo que son igualmente costosos cuando hay que contratarlos a las firmas comercializadoras. Programa elaborado para el manejo del secuenciador y el sistema de HPLC Aunque existen programas que controlan sistemas similares al que describimos en este trabajo todos responden a la configuracion del fabricante. Debido a esto fue necesario elaborar un programa que sincronizara el trabajo de todos los elementos (secuenciador, sistema de HPLC, adquisicion de la senal de absorbancia y procesamiento de los cromatogramas) en tiempo real, manejados desde una computadora personal. Dicho programa fue confeccionado en el lenguaje Turbo Pascal version 7.0. Su estructura es de forma jerarquica compuesta por un menu principal y submenues asociados al mismo.
Las funciones que realiza son las siguientes:
- ejecutar los programas de usuario. Durante la ejecucion el programa puede ser modificado por el usuario e interrumpido a voluntad - brindar un conjunto de programas utilitarios para la comprobacion y ajuste del secuenciador, cambio o llenado de los frascos de reactivos y solventes y lavado de las tuberias y camaras - permitir el control manual de las valvulas - controlar las temperaturas del reactor y del convertidor, cuyos puntos de consigna son establecidos por el usuario - controlar el encendido del detector de luz ultravioleta y su autocero - controlar las bombas del sistema de HPLC de acuerdo al programa de gradiente seleccionado - adquirir la senal de absorbancia ciclo a ciclo y almacenarla en el fichero seleccionado por el usuario - procesar la senal adquirida, detectando e identificando los picos segun los parametros establecidos por el usuario y mostrando el cromatograma en la pantalla si se desea - crear tablas de calibracion y tablas de picos para la identificacion - procesar los cromatogramas, mostrando la sustraccion de dos cromatogramas consecutivos y otras tareas - seleccionar diferentes parametros para la impresion de los cromatogramas y las sustracciones, asi como la tabla de calibracion y la tabla de picos identificados con los picomoles calculados
Para el control del secuenciador se utilizan en la computadora dos tarjetas de entrada/salida programables, cada una de 32 bits de entrada o de salida. La adquisicion de la senal de absorbancia se realiza con una tarjeta que ademas puede controlar un registrador. El control de las temperaturas del reactor y del convertidor se ejecuta por un control tipo proporcional-integral-derivativo (PID), a traves de una tarjeta analogica/digital de alta prestacion Advantech Co. Ltd. (modelo PCL- 818). Control del sistema de HPLC Para probar la efectividad de la direccion del sistema de HPLC se evaluo la repetibilidad de los tiempos de retencion durante cinco corridas de - lactoglobulina b (18 ciclos). La Figura 3 muestra una tendencia a aumentar la diferencia entre los tiempos de retencion obtenidos y los del estandar. No obstante, pudimos comprobar que esta diferencia no llega a ser mayor de 0,15 min en el ciclo 60 por lo que es posible realizar la asignacion de los residuos correspondientes sin ambiguedad. Los principales factores que originan este fenomeno son la diferencia de volatilidad existente entre los componentes del tampon A y la reproducibilidad de los flujos que es posible lograr en una separacion por gradiente. Por tanto estas pequenas variaciones en los tiempos de retencion pueden considerarse un fenomeno inherente a la cromatografia y no un producto de la automatizacion de la inyeccion ni del control de las bombas de HPLC.
En la Tabla 1 se muestran las entregas de reactivos y solventes que se realizan durante un ciclo de secuencia y el consumo por ciclo de los reactivos y solventes. Los valores obtenidos son comparables con los reportados para la version compacta del secuenciador de fase gaseosa (3). El tiempo total del ciclo de 36 min y 33 s (Tabla 1) se encuentra en el rango de los equipos actuales (25-50 min). Reducciones posteriores podrian realizarse utilizando variantes mas rapidas de separacion de los PTH- aminoacidos. En los cromatogramas (Figura 4) se puede apreciar la elucion de los principales subproductos de las reacciones, la dimetilfeniltiourea (DMPTU, pico 4) con 18 pmol en el ciclo 1 que disminuyen hasta 8 pmol en el ciclo 4, la difenilurea (DPTU, pico 5) con una disminucion de 7 a 1,5 pmol y el ester metilico de la tioanilina (ATM, pico 6) de 95 a 50 pmol. Ninguno de los tres coincide en la elucion con los derivados de los aminoacidos mas comunes en las proteinas. De las otras senales de fondo que se observan, la mas significativa (pico 1) disminuye de 4 a 1 pmol y eluye muy cercano al PTH-aspartico, las senales restantes (picos 2, 3, 8 y 9) son de 1-2 pmol en el primer ciclo y llegan a desaparecer. El pico 2 puede obstaculizar la asignacion de la asparagina en el primer ciclo si se trabaja en el orden de los 10 pmol de muestra.
Durante la secuenciacion de una proteina o peptido se suman diversos factores que provocan la caida de los rendimientos de un ciclo a otro. Entre ellos pueden citarse la perdida de muestra durante los lavados para la extraccion de los subproductos no volatiles, los propios rendimientos de las reacciones de acoplamiento y ruptura y otros dependientes de la secuencia aminoacidica de la muestra en estudio (1, 8, 9). La eficiencia de degradacion de los secuenciadores automaticos se evalua a traves de sus rendimientos inicial y repetitivo. Pequenos aumentos en estos valores se traducen en un numero considerable de residuos que se pueden identificar (1, 2). En los secuenciadores actuales el valor del RI oscila entre el 50- 60 %, mientras que el RR se encuentra en el rango de 92-98 % (3, 8). En la Tabla 2 mostramos el RR obtenido en cinco corridas de 200 pmol de la proteina estandar, -lactoglobulina b. En el calculo del RR se utilizan pares de aminoacidos con diferente comportamiento ante la quimica de los secuenciadores. Los valores alcanzados para el RR oscilan entre 94-98 % y para el RI entre 57-74 %.
Los grandes esfuerzos dedicados a reducir las cantidades de muestra requeridas para lograr la mayor cantidad de informacion posible han permitido que hoy se consideren de rutina secuencias con cantidades de muestra entre los 10 y los 100 pmol. Con estas cantidades de muestra se obtiene informacion para un minimo de 10 ciclos (10). Para conocer la cantidad de residuos posibles a identificar con los rendimientos alcanzados, se realizaron corridas con distintas cantidades de muestra aplicada al secuenciador. Los resultados obtenidos (Tabla 3) muestran un comportamiento similar al de los equipos comercializados hoy en dia.
--------------------------------------------------------------------------- Tabla 3. Valores promedios del numero de residuos identificados para cada cantidad de muestra aplicada al secuenciador y su desviacion est ndar. Los n£meros entre par‚ntesis indican la cantidad de corridas realizadas en cada caso. --------------------------------------------------------------------------- Picomoles aplicados Residuos identificados --------------------------------------------------------------------------- 200 (n = 4) 51+/-5 100 (n = 2) 35+/-1 50 (n = 2) 27+/-2 20 (n = 3) 20+/-4 -------------------------------------------------------------------------- Secuenciacion de peptidos La Figura 5 muestra los rendimientos obtenidos en la secuenciacion de peptidos de diferentes tamanos. Para el peptido St1 de 26 residuos se obtuvo informacion en 24 ciclos partiendo de 56 pmol identificados en el primer ciclo de secuencia. No se pudieron detectar la histidina del ciclo 16 y el triptofano del 17 debido a los bajos rendimientos que usualmente se logran con estos residuos. En el caso de la histidina se debe a la dificultad para extraer el derivado de ATZ de la membrana de PVDF por el solvente organico utilizado y en el del triptofano a que una parte considerable de este aminoacido se destruye durante las reacciones de derivatizacion. Para el peptido St2, de 37 aminoacidos se obtuvo informacion de 19 residuos. En la Figura 4 se muestran los cuatro primeros ciclos de la secuencia de este peptido. Se detectaron 3 pmol en el primer ciclo por lo que considerando un rendimiento inicial promedio de 64 % (Tabla 2) se obtiene una cantidad aplicada al secuenciador de 10 pmol. No fue posible identificar el triptofano en el ciclo 18. Secuenciacion de proteinas transferidas a PVDF Entre los metodos que mas exito han obtenido en el microaislamiento de proteinas para el analisis de secuencia se encuentran la separacion en geles de poliacrilamida seguida de la transferencia de las bandas de proteinas a membranas de PVDF. Este procedimiento permite la secuenciacion de unos pocos picomoles e incluso fentomoles de proteina. En la Figura 5 C se muestran los rendimientos alcanzados en la secuenciacion de una proteina transferida. Para esa muestra se obtuvieron 30 ciclos de secuencia partiendo de 26 pmol, con un RR de 98 %.
El primer criterio para evaluar la utilidad de un secuenciador de proteinas lo constituye el rendimiento de la degradacion ciclo a ciclo. Esto determina la cantidad de informacion que sera posible obtener a partir de la muestra aplicada. Los resultados presentados en este trabajo demuestran que el secuenciador de proteinas S6000 permite obtener informacion de secuencia de proteinas y peptidos con rendimientos repetitivos de 94-98 %. Lo anterior es valido tanto para muestras aplicadas en solucion como para las transferidas a una membrana de PVDF. Las senales de fondo en los cromatogramas se encuentran en el orden de los 2-4 pmol en el primer ciclo de secuencia y menos de 1 pmol del ciclo 2 en adelante. El tiempo del ciclo obtenido es de 36 min 33 s. El secuenciador y el sistema de HPLC son controlados mediante una computadora personal IBM compatible. Se desarrollo un programa que brinda numerosas facilidades de operacion, permite la adquisicion de la senal de absorbancia y el procesamiento de los cromatogramas.
El S6000 es compacto y robusto. Su construccion resulta economicamente ventajosa y el consumo de reactivos y solventes es comparable al de otros equipos descritos en la literatura (3). Agradecimientos Agradecemos al Dr. Carlos Fernandez-Patron por suministrarnos la membrana de PVDF con la proteina transferida. Referencias 1. Edman P, Begg G. A protein sequenator. European Journal of Biochemistry 1967;1:80-91. 2. Hunkapiller MW, Hewick RM, Dreyer WJ, Hood LE. A new protein microsequenator using gas phase Edman reagents. En: Elzinga M (Eds.), Methods in Protein Sequence Analysis 1982:77-90. 3. Calaycay J, Rusnak M, Shively JE. Microsequence analysis of peptides and proteins. Analytical Biochemistry 1991; 192:23-31. 4. Fisher S, Reimann F, Wittman-Liebold B. A new modular sequencer. Journal of Protein Chemistry 1988;7:224-225. 5. Rusnak M, Shively JE, Calaycay JR. 1992; U.S. Patent No. 5, 137, 695. 6. Alvarez C, Tejuca M, Morera V, Besada V, Pazos F, Lanio ME, Padron G. Novel primary structure of Sticholysin and its interaction with membranes. Toxicon 1996; 34:3. 7. Wittmann-Liebold B. En: Beers RF Jr, y Basset EG (eds.), Polypeptide Hormones 1980; 87-120. 8. Ashman K. The use of on-line high performance liquid chromatography for phenylthiohidantoin amino acid identification. En: Wittman-Liebold B, Salnikow J, y Erdmann VA (eds.), Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis 1986; cap 4:219. 9. Tempst P, Geromanos S, Elicone C, Erdjument-Bromage H. Improvements in microsequencer performance for low picomole sequence analysis. METHODS: A Companion to Methods in Enzimology 1994; 6:248-261. 10. Bailey JM. Chemical methods of protein sequence analysis. Journal of Chromatography A 1995;705:47-65. Copyright 1997 Elfos Scientiae The following images related to this document are available:Line drawing images[ba97004d.gif] [ba97004a.gif] [ba97004b.gif] [ba97004c.gif] [ba97004e.gif] |
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