Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 97-99

.Evaluacion del poder irritante de una formulacion de factor de crecimiento epidermico humano recombinante en conejos

*Sandra Valdes,^1 Gipsy Quintero,^1 Yamile Vega,^1 Raquel Lazcano^2 y Xiomara lvarez^1

^1 Departamento de Farmacologia y Toxicologia, Centro de Quimica Farmaceutica, Calle 200 esq. 21 Atabey, Playa, apartado postal 16042, La Habana, Cuba.
^2 Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, La Habana, Cuba.

Recibido en enero de 1996. Aceptado en diciembre de 1996.

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ABSTRACT

We studied the dermic and eye irritancy effect of human recombinant epidermal growth factor. We used the Draize test in albin rabbits to determine the dermic and eye irritation indexes. We did not observe signs of skin irritation and the value of the primary irritation index was 0. The conjunctival effects were mild and disappeared after 72 h. The eye irritancy index was less than 10. We concluded that this formulation is not irritant and can be used in therapy.

Key words: dermic irritation, eye irritation

RESUMEN

Se evaluo el efecto potencial de irritacion local dermica y oftalmica, despues de la administracion del factor de crecimiento epidermico (EGF) humano recombinante. Para determinar los indices de irritabilidad dermica primaria (IIP) y oftalmica (IIO) se utilizo el metodo de Draize, y se emplearon como biomodelos conejos albinos. El valor resultante del IIP fue de 0, al no observarse signos de irritacion cutanea en los animales tratados. Se apreciaron efectos conjuntivales ligeros, que desaparecieron en un periodo de 72 h. El IIO obtenido fue menor que 10, por lo cual se concluye que la formulacion de EGF no es irritante y se avala su uso en la terapia.

Palabras claves: irritabilidad dermica, irritabilidad oftalmica

Introduccion

La epidermis constituye la primera linea de defensa ante exposiciones fisicas, quimicas y termicas. A pesar de esto, el hombre puede verse expuesto a serios danos en la piel, como resultado del contacto accidental por el empleo diario de un producto de uso industrial, domestico o de un medicamento. Al igual que la piel, las membranas mucosas de los ojos estan sometidas al ataque de agentes externos, por lo que los compuestos quimicos que tienen diferentes usos y patrones de exposicion deben ser evaluados para su seguridad (1).

En 1944, Draize y colaboradores (2), propusieron el test de irritabilidad dermica primaria y un sistema de gradacion para los posibles efectos causados en la piel. A pesar de ser un metodo utilizado en la actualidad, existe un conjunto de regulaciones (3-6) que lo han modificado con el objetivo de proteger al hombre. Aunque algunos investigadores tratan de simplificar el problema de la irritabilidad provocada por contacto accidental al ensayar una sustancia que se aplica sobre la piel, el cientifico debe suponer que toda sustancia quimica puede ser un potente irritante dermico (7).

El factor de crecimiento epidermico humano recombinante (EGF-hr) es una simple cadena polipeptidica de 53 restos aminoacidicos y un peso molecular de 6045 Da que fue aislada inicialmente de la glandula submaxilar (8).

Los estudios preliminares sobre el EGF han demostrado sus propiedades en lo que a maduracion y mitosis se refiere (9). Otras evidencias han probado que el EGF no es solo un factor de induccion mitotica sino ademas un elemento promotor de la migracion celular (10).

Distintas investigaciones plantean su posible uso en Oftalmologia (11), tratamiento de ulceras gastricas (12), Oncologia (13) y en el tratamiento de quemaduras, en los cuales se logro una reduccion significativa del tiempo de cicatrizacion.

El objetivo de este ensayo consistio en evaluar el efecto potencial de irritacion local dermica y el grado de irritabilidad oftalmica producida por este medicamento en conejos albinos, despues de una sola administracion.

Materiales y Metodos

La crema compuesta por 10 mg/g de principio activo de EGF-hr, sulfadiacina de plata al 1 % y excipiente hidrofilo, se empleo en el estudio de irritabilidad dermica. El EGF-hr se utilizo a una concentracion de 10 ug/mL en el ensayo de irritabilidad oftalmica. Tanto la crema, como el principio activo EGF-hr, fueron producidos por el Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia (CIGB, La Habana).

La fluoresceina sodica se obtuvo de BDH Chemicals Ltd Poole, Inglaterra. Los componentes del colirio (cloruro de benzalconio, alcohol benzilico y alcohol feniletilico) fueron suministrados por la Industria Medico Farmaceutica (IMEFA, La Habana).

Animales

Se emplearon 21 conejos albinos, machos, de 2,5 kg de peso corporal, procedentes del Centro Nacional de Produccion de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana), distribuidos de la siguiente forma: tres animales para el ensayo de irritabilidad dermica y dieciocho para el estudio de irritabilidad oftalmica.

Metodos

Se realizaron los ensayos de irritabilidad en el siguiente orden:

1. Estudio de irritabilidad dermica.

La piel de los animales fue tratada siguiendo los lineamientos trazados por la Comunidad Economica Europea (CEE) (6). Veinticuatro horas antes del inicio del ensayo se depilaron la espalda y los flancos de cada animal y se seleccionaron los animales de piel sana, teniendo en cuenta lo planteado por Nixon y colaboradores en 1975 (14) acerca de la posibilidad de que una reaccion mas severa puede ser esperada en piel danada, lo cual hace que el modelo animal sea mas sensible.

Una vez depilados los animales, se escogieron dos sitios por cada uno para la administracion de la crema. El sitio se cubrio con un parche de gasa quirurgica y se fijo con una cinta adhesiva hipoalergica. Al cabo de las 4 h se retiro el vendaje y el sitio tratado se lavo con agua destilada. En cada animal se examinaron los signos de eritema y edema, asi como la formacion de escaras a los 60 min y a las 24, 48 y 72 h de haber retirado el parche.

Antes de aplicar la crema se determino el pH de una preparacion acuosa al 10 % de la sustancia.

2. Estudio de irritabilidad oftalmica.

Han sido propuestos muchos sistemas de clasificacion para los irritantes oculares. Algunos han sido publicados en la literatura (15, 16) y en varios lineamientos de ensayo. La Organizacion para la Cooperacion y Desarrollo (OCDE) (4) ha adoptado basicamente la interpretacion de Green y colaboradores (15) y el Consejo Nacional de Investigaciones de la Ciencia de la Academia Nacional (NAS-NRC) (17).

Los ojos de los animales fueron tratados, al igual que en piel, siguiendo los lineamientos de la CEE (6). Ambos ojos (tratado y control) se examinaron 24 h antes de iniciar el ensayo anadiendo una gota de fluoresceina sodica al 2 % en cada uno se lavaron con cloruro de sodio al 0,9 % y se observaron bajo lampara de luz ultravioleta.

La sustancia de ensayo se aplico en el fondo del saco conjuntival y 1 h despues de la aplicacion, el ojo tratado se lavo con cloruro de sodio. En cada animal se examinaron los signos de lesiones corneales, de iris y conjuntiva luego de la aplicacion de una gota de fluoresceina sodica en ambos ojos y la observacion bajo lampara de luz ultavioleta a los tiempos previstos (1, 24, 48, 72, 96 y 168 h) despues de la aplicacion.

Antes de aplicar la formulacion se determino el pH de una preparacion acuosa al 10 % de la sustancia.

Se utilizaron seis animales por grupo. La composicion de cada tratamiento fue la siguiente:

- Tratamiento 1. EGF-hr + alcohol bencilico al 0,5 %.

- Tratamiento 2. EGF-hr + alcohol bencilico y alcohol feniletilico al 0,9 %.

- Tratamiento 3. EGF-hr + cloruro de benzalconio al 0,01 %.

Se analizo y registro la reaccion de piel y ojos a los tiempos referidos con anterioridad. Los valores resultantes se obtuvieron basados en el sistema de evaluacion de Draize para la graduacion de la intensidad de la reaccion cutanea y las lesiones oculares en escalas de 0 a 4.

- Teniendo en cuenta estos valores se calculo el indice de irritacion primario (IIP).
Figure 1.

 donde:
 ER: sumatoria del numero de eritema
 ED: edemas observados en cada animal, sitio y en tiempo.
 a = 1....na                        na: numero de
animales
 s = 1....ns                        ns: numero de
sitios
 t = 1.....nt                        nt: numero de
tiempos
 ER^ ast: ER observado en el animal a, en el
sitio s, en el tiempo t
 ED ^ast: ED observado en el animal a, en el
sitio s, en el tiempo t 
. Puntaje de las lesiones oculares (P).
o P = A x B x 5 + A1 x 5 + ( A^2
+ B^1 + C) x 2
 donde:
 A: opacidad corneal
 B: area de la cornea involucrada
 A^1: iris
 A^2: eritema
 B^1: edema
 C: secreciones

Resultados y Discusion

Estudio de irritabilidad dermica

Al determinar el pH de la crema se obtuvo un valor de 8,3, el cual se encuentra en el rango de aceptacion planteado por las agencias regulatorias que eliminan todas aquellas sustancias con pH menores que 2,5 y mayores que 11,5.

En los animales tratados no se encontraron signos de irritacion cutanea, a pesar de haber realizado el experimento a una concentracion de 10 mg/g de crema, lo cual supera la forma de aplicacion en la clinica, que es la crema de Hebermin con 10 ug/g; con ello se obtuvo obteniendose un indice de irritabilidad dermica igual a 0.

Se ha planteado que el conejo, a pesar de ser el modelo experimental empleado en los ensayos, tiende a exagerar la respuesta (18) y reacciona de forma mas sensible que el hombre a varias sustancias quimicas. De ahi que la sustancia fue denominada NO IRRITANTE segun la clasificacion de Draize (2), lo cual avala su uso en la terapia contra quemaduras asi como en cosmeticos.

Estudio de irritabilidad oftalmica

Al determinar el pH de la formulacion se obtuvo un valor de 8, que se encuentra en el rango de aceptacion planteado por las agencias regulatorias.

Al interpretar los resultados de la evaluacion final para la irritabilidad oftalmica, se debe tener en cuenta la significacion biologica de los cambios oculares.

Existen cuatro categorias de datos generados por el ensayo de Draize que son considerados cuando se interpretan los resultados: tipos de efectos oculares, severidad, reversibilidad y rango de incidencia (4). Todas estas categorias estan interrelacionadas. Los puntajes individuales no representan un estandar absoluto de la irritacion de un material (19).

En la Tabla 1 pueden observarse los signos por animal para los diferentes grupos de tratamiento. En los grupos de tratamiento 1 y 2, los signos evidenciados fueron eritema, edema y secrecion en dos animales, mientras que en el tratamiento 3 pudo apreciarse fundamentalmente, eritema y secrecion de grado 1 en dos animales. Al analizar la severidad de los danos, se obtuvieron los siguientes indices: 2,0; 3,0 y 1,6 para los tratamientos 1, 2 y 3, respectivamente.

Tabla 1. Lesiones oculares observadas en los animales, a los diferentes tiempos por grupos de tratamiento.

---------------------------------------------------------------------------
                                  Tratamiento
             --------------------------------------------------------------
Parametro  Tiempo (h)      1                   2                  3
---------------------------------------------------------------------------
Conjuntiva          1  2  3  4  5  6    1  2  3  4  5  6   1  2  3  4  5  6
---------------------------------------------------------------------------
  A          1      1           1          1  1            1           1  
            24      2           1          2  2            1           1  
            48      2           1          2  2            1           1  
            72      1           1          1  1            1           1 
  B          1      1                                         
            24      1           1          2  1            1          
            48      1           1          2  1            1          
            72                             1                        
  C          1      1                      2  1            1           1 
            24      2                      2  2            1           1 
            48      2           1          2  1            1           1 
            72      1           1          1  1            1           1 
---------------------------------------------------------------------------

Teniendo en cuenta los datos obtenidos y la clasificacion segun el metodo cubano (20) (no irritante, ligeramente irritante, moderadamente irritante e irritante severo), podemos clasificar las tres formulaciones oftalmicas como NO IRRITANTES.

En las formulaciones estudiadas, los efectos oculares observados fueron ligeros y desaparecieron en un periodo de 72 h. Si tenemos en cuenta los efectos oculares, el rango de incidencia y la reversibilidad, podemos concluir que la tercera formulacion es la mas adecuada para su uso en preparaciones oftalmologicas.

Referencias

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3. OECD. Data interpretation guides for initial hazard assessment of chemicals. OECD, 1984. Paris.

4. EEC. Council Directive 79/831/EEC (September 18). Annex V, Part B: Methods for the determination of toxicity. Annex. VII: 4.1.5. Acute toxicity, skin irritation. Off. J Europ Common 1979;22, (L 259), 10.

5. EEC. Directiva 79/831/EEC. Anexos VII y VIII, Parte B: Metodos para la determinacion de la toxicidad. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. 1992;N L 383 A/107.

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