Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997

Obtencion y caracterizacion parcial de anticuerpos monoclonales generados contra la hormona luteinizante humana

*Bertha V Rodriguez Pendas, Ada J Machado Curbelo, Celeste Arranz Calzado, Elena Noris Rodriguez, Aimee lvarez lvarez y Roberto M Gonzalez Suarez

Departamento de Diabetes, Instituto Nacional de Endocrinolog¡a. Hospital Comandante "Manuel Fajardo". Zapata y D, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

Recibido en agosto de 1996. Aceptado en enero de 1997.

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ABSTRACT

Monoclonal antibodies against luteinizing hormone (LH) were produced immunizing BALB/c mice with LH isolated in the INEN. They were IgG1 class and they were purified from ascitis fluid by affinity chromatography using protein A Sepharose. The antibodies were evaluated by the isotopical method in liquid phase and two of them were selected for a sandwich ELISA, according their characterization. This system was used for LH determination in serum samples, between 0.7 and 100 mU/mL and the sensibility of 0.2 mU/mL.

Key words: glycoprotein hormones, hybridomas,immunoenzimatic assays

RESUMEN

Se describe la produccion de anticuerpos monoclonales de raton dirigidos contra la hormona luteinizante (LH), a partir de la inmunizacion de ratones BALB/c con LH hipofisaria humana purificada en el INEN (Instituto Nacional de Endocrinologia). Los anticuerpos obtenidos son de la clase IgG1 y fueron purificados a partir de liquido ascitico mediante cromatografia de afinidad con proteina A Sepharosa. Estos anticuerpos fueron evaluados por su capacidad de union a un trazador radioactivo en fase liquida, los resultados de su caracterizacion permitieron emplear dos de ellos en un sistema ELISA tipo sandwich, para determinar la LH en suero con un rango entre 0,7 y 100 mU/mL y una sensibilidad de 0,2 mU/mL.

Palabras claves: hormonas glicoproteicas, hibridomas, ensayo inmunoenzimatico

Introduccion

La hormona luteinizante (LH) es una glicoproteina secretada por el lobulo anterior de la hipofisis que junto a la gonadotropina corionica (CG), la hormona estimulante del tiroide (TSH) y la foliculo estimulante (FSH) constituyen una familia de polipeptidos relacionados estructuralmente. Cuentan con una subunidad comun a ellas (alfa) y una subunidad (beta) responsable de la actividad biologica especifica para cada una (1). La LH juega un papel importante como marcador del momento de la ovulacion, en la regulacion de la ovulacion y en la funcion ovarica durante el control del ciclo menstrual (2), por lo que su medicion rapida y sensible es de gran importancia en los estudios clinicos y basicos de la regulacion de la fertilidad debido a la corta vida media de circulacion y la variacion de las concentraciones de esta hormona durante el ciclo menstrual. La determinacion de LH se ha realizado tradicionalmente por radioinmunoensayo (RIA) utilizando anticuerpos policlonales (3), pero las reacciones cruzadas hacen poco precisos los resultados, por lo que recurrir a la tecnologia de produccion de hibridomas es una ventaja en este sentido ya que permite disponer de poblaciones homogeneas de anticuerpos los cuales por su especificidad y suministro ilimitado permiten estandarizar los ensayos realizados (4). Ademas, la necesidad de metodos sencillos y rapidos para determinar el momento de la ovulacion como requisito de los llamados metodos naturales de contracepcion.

En este articulo se reporta el proceso de generacion y caracterizacion de cinco hibridomas secretores de AcM anti-LH humana y la utilizacion de dos de ellos en un sistema de inmunoensayo.

Materiales y Metodos

Inmunizacion

Se inmunizaron ratones BalB/c por via subcutanea en los dias 0, 15 y 21 con dosis de 20 ug de LH humana aislada y purificada en el Instituto Nacional de Endocrinologia (INEN) (5). Para la primera dosis el antigeno fue emulsionado con adyuvante completo de Freund; en las restantes se empleo adyuvante incompleto. Al animal con mayor titulo de anticuerpos se le administro una ultima dosis sin adyuvante por via intravenosa los tres dias antes de la fusion.

Fusion y cultivo de hibridomas

Para la hibridizacion se siguio esencialmente el metodo sugerido por Kohler en 1981 (6), empleando mieloma de raton P3X63Ag8, 653; como agente promotor de la fusion se utilizo polietilenglicol 1 500 (BDH) y una relacion mieloma-celulas esplenicas de 1 a 10; como cultivo de celulas alimentadoras se utilizaron esplenocitos provenientes de un raton no inmunizado. Las celulas fundidas se sembraron en placas Costar de 96 pozos a una concentracion de 100 000 celulas/mL de medio.

El medio de cultivo utilizado fue RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 17 mM de NaHCO3 (Gibco), 18 mM de Hepes (Gibco), 2 mM de glutamina (Gibco) 1 mM de piruvato de sodio (Gibco), 40 ug/mL de gentamicina (Pharmachin), 0,05 mM de 2-mercaptoetanol (BDH) y 20 % de suero de ternero fetal (Gibco), en el caso del medio selectivo durante los primeros 14 dias despues de la fusion se adiciono hipoxantina 10 mM, aminopterina 4 x 10-7 M y timidina 1,6 x 10-5 M.

Aproximadamente a las dos semanas de cultivo se realizo el tamizaje primario de los sobrenadantes para determinar la presencia de anticuerpos anti-LH, empleando un RIA en fase liquida.

Clonaje y expansion de hibridomas

Los cultivos de hibridomas seleccionados para la produccion se clonaron y reclonaron por el metodo de dilucion limitante (7) y expandieron en frascos de cultivos, los cuales fueron utilizados para la recuperacion de AcMs a partir de los sobrenadantes, asi como para la crioconservacion de las celulas y su inoculacion a ratones.

Sistema de deteccion de anticuerpos

Para el tamizaje de la presencia de anticuerpos anti-LH en los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas o sus ascitis se utilizo un metodo isotopico en fase liquida a partir del cual 100 uL de las muestras fueron incubadas con 100 uL de LH marcada con I125 y 250 uL del tampon fosfato, pH 7,4 por 16 h a 4 C. La union antigeno-anticuerpo fue precipitada por adicion de 100 uL de suero normal de raton, 100 uL suero antitotal de raton y 300 uL de PEG (6 000) al 15 % en solucion EDTA e incubada por 1 h a temperatura ambiente, centrifugada 30 min a 2 000 g y la radioactividad del precipitado obtenida por conteos en un contador gamma LKB. Se establecieron controles de radioactividad total y de union inespecifica, asi como controles negativos (sobrenadante de cultivo de un hibridoma no relacionado) y positivo (suero de raton utilizado en la fusion).

Determinacion del isotipo de los AcMs

Se empleo un kit para la determinacion de clases y subclases de AcM proveniente de la Amersham, con antisueros clasificadores y sobrenadantes de cultivos de los hibridomas estudiados.

Purificacion de AcMs

Para la produccion de liquido ascitico tumoral rico en AcM se inocularon 3 millones de celulas hibridas en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c, preinyectados 10 dias antes con 0,5 mL de aceite mineral por la misma via. El liquido ascitico colectado se distribuyo en alicuotas para su conservacion a -20 C y su posterior purificacion.

La purificacion de los AcM a partir de fluido ascitico se realizo por cromatografia de afinidad en una columna con proteina A Sepharosa CL 4B (Pharmacia), siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante para las inmunoglobulinas de raton de las diferentes clases; la muestra se diluyo a partes iguales con tampon glicina 1,5 M, NaCl 3 M y se utilizo como solucion de elucion citrato de sodio 0,1 M a diferentes pH (8). La actividad de las eluciones y de la ascitis antes de purificar se realizo en un RIA en fase liquida con iguales condiciones a las ya descritas. Todas las determinaciones de proteina se hicieron por el metodo de Lowry (9) y como criterio de pureza se efectuo una inmunoelectroforesis en gel de agarosa al 1,25 % en tampon veronal 0,0075 M pH 8,6, utilizando un suero antitotal de raton segun lo descrito por Ouchterlony (10).

Desplazamiento de los AcMs. RIA en fase liquida

Con vista a evaluar el comportamiento de los anticuerpos producidos, en un sistema de radioinmunoensayo, se estudio la curva de desplazamiento del trazador por la LH nativa.

Para esto se utilizaron diluciones de cada AcM con un 20 % de union a la LH-I125 en RIA fase liquida, anadiendo 100 uL de LH estandar con las diferentes concentraciones de dicha hormona: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 y 1,56 mU/mL, en algunos casos se aumento el rango por encima de 50 para lograr una curva de desplazamiento del anticuerpo aceptable.

Especificidad

Para determinar la posible reaccion cruzada de nuestros anticuerpos con las hormonas glicoproteicas estructuralmente relacionadas, se realizo un RIA en fase liquida con las mismas condiciones experimentales al descrito previamente para la deteccion de anticuerpo, en este caso anadiendo 100 uL de hCG, TSH y FSH a concentraciones desde 1 000 ng\mL hasta 31,2 ng\mL para los hibridomas LH12 y LH11; y hasta 1 ng\mL para el LD4, LH8 y LG7.

Determinacion de la constante de afinidad de los AcMs

La afinidad de los AcMs fue determinada por analisis de Scatchard (11), utilizando las curvas de desplazamiento en RIA en fase liquida de los anticuerpos con altas concentraciones de estandar, a partir de las cuales se calcularon los parametros requeridos para determinar la constante de afinidad (Ka) de cada anticuerpo.

Aplicacion de AcMs anti-LH. Ensayo inmunoenzimatico

Para el desarrollo de un micro ELISA tipo "sandwich" en la determinacion de LH en muestras de suero, se recubrieron placas de cloruro de polivinilo durante 16 h a temperatura ambiente y en camara humeda, con 100 uL/pozo del anticuerpo policlonal 1 046 a una concentracion de 5 ug/mL en tampon bicarbonato 0,1 M, pH 9,6 (12); despues de lavar dos veces con Tris-Tween 20 al 0,05 % se anadio 100 uL de LH estandar a concentraciones desde 100 hasta 0,5 mU/mL, durante 1 h a temperatura ambiente, se repitieron los lavados y se anadio 100 uL de los AcMs LH12 a 5 y 10 ug/mL y el LH8 a 10 y 20 ug/mL en la misma solucion de lavado con 1 % de BSA, 1 h a las mismas condiciones descritas, inmediatamente se lavo y se depositaron 100 uL de una dilucion 1/10 000 de un antisuero comercial antiIgG de raton conjugado con peroxidasa (Amersham); despues de 1 « h de incubacion las placas se lavaron cinco veces para anadir 200 uL de la solucion de sustrato en solucion citrato fosfato. La reaccion se detuvo con 50 uL de H2SO4 2.5N y se leyo a 492 nm en un equipo SUMA (Sistema Ultramicroanalitico) modelo 121 (13). Como controles se emplearon sueros humanos con concentraciones de LH altas, medias y bajas determinadas por RIA.

Resultados y Discusion

A partir de la tecnica de fusion se obtuvieron hibridomas en el 87 % de los pozos, los cuales se clonaron y reclonaron y dieron lugar a cinco clones estables que se denominaron LH11, LH12, LG7, LH8 y LD4.

El estudio de isotipo con antisueros especificos demostro que los cinco

AcMs son del tipo IgG1, kappa.

Con la cromatografia de afinidad en una columna de proteina A inmovilizada en Sepharosa, se obtuvieron preparaciones con un elevado grado de pureza, se comprobo el resultado por la inmunoelectroforesis, donde se enfrentaron los anticuerpos purificados a un suero antitotal de raton; se observo una sola linea de precipitacion.

La Figura 1 muestra un ejemplo representativo del patron de elucion a diferentes pH del tampon citrato, en este caso para el hibridoma LH12. Como se sabe, los contaminantes eluyen en el tampon glicina, mientras que las inmunoglobulinas lo hacen en el tampon citrato a pH entre 6 y 3 acorde a la subclase de anticuerpo.

Figura 1. Purificacion representativa de un anticuerpo monoclonal anti-LH (AcM LH12), por columna de afinidad.

Al medir la actividad anti-LH frente al trazador (LH-Iodo125) en fase liquida, solo se encontro en la fraccion que eluyo con el tampon citrato a pH 6 para los clones LH12, LH11, LD4 y LH8 y a pH 5 para el LG7.

En todos los casos, las muestras procesadas eran capaces de atrapar entre un 20 y un 30 % de la cantidad del trazador anadido, aproximadamente 10 000 cpm (conteos por minutos) en dependencia de la concentracion del anticuerpo y de su afinidad.

En relacion con las curvas de desplazamiento de los AcMs obtenidos, puede observarse en la Figura 2 que las concentraciones de LH capaces de desplazar de un 20 a un 80 % del trazador anadido se encontraba en el rango de 50-1 000 mU\mL, excepto para el LG7.

Figura 2. Curvas de desplazamiento de los cinco anticuerpos monoclonales anti-LH por radioinmunoensayo.

Este desplazamiento de poca sensibilidad con respecto a los antisueros policlonales, es propio de los anticuerpos monoclonales en este tipo de ensayo en fase liquida y se explica ademas porque la afinidad por el antigeno de los mismos es frecuentemente inferior a la de los antisueros convencionales, compuestos estos ultimos por varios isotipos de inmunoglobulinas con diferentes afinidades y anticuerpos contra varios de los determinantes del antigeno de interes; esto hace que los anticuerpos policlonales exhiban una cierta homogeneidad de comportamiento en diferentes tecnicas inmunologicas (14). Los resultados de la especificidad de los anticuerpos obtenidos, en relacion con el resto de las hormonas glicoproteicas por presentar gran homologia en su cadena alfa con la LH, pueden apreciarse en las Figuras 3-6.

Figura 3. Estudio de especificidad del anticuerpo monoclonal LH8.

Figura 4. Estudio de especificidad del anticuerpo monoclonal LH12.

Figura 5. Estudio de especificidad del anticuerpo monoclonal LH11.

Figura 6. Estudio de especificidad del anticuerpo monoclonal LD4.

El estudio de especificidad realizado con las hormonas hipofisiarias FSH, hCG y TSH a concentraciones 100 veces superior al rango de trabajo de las curvas de calibracion de la LH utilizada y ademas del rango fisiologico y patologico en las que estas hormonas se encuentran en el suero humano, no desplazo la union de los anticuerpos monoclonales a la LH marcada en ninguna de estas, lo cual significa que no se encontro reaccion cruzada con estas hormonas. Con estos resultados podemos afirmar, ademas, que los AcMs estudiados reconocen la subunidad beta de la LH y que en ningun caso reaccionan con la subunidad alfa.

Los anticuerpos monoclonales LH11, LH12, LH8 y LD4 mostraron un valor de ka de 1,3 x 10^9; 2,1 x 10^10; 2,5 x 10^10 y 1,2 x 10^9 M^-1, respectivamente, lo cual es aceptable para este tipo de anticuerpos (15); estos resultados son similares a los encontrados con otros AcMs contra la LH (16) y otras hormonas glicoproteicas, reportados por otros autores (17, 18).

En la Figura 7 se observa que la grafica de Scatchard fue lineal dentro de los limites del error experimental, lo que constituye otro argumento a favor de la monoclonalidad de estos anticuerpos, unido a los resultados de la purificacion.

Figura 7. Ploteo de Scatchard para determinar la constante de afinidad de los anticuerpos monoclonales.

Sin embargo para el LG7 no fue posible el estudio de la especificidad, ni el calculo de su constante de afinidad mediante el analisis de Scatchard debido a que no se pudo lograr una curva de desplazamiento util, aun a concentraciones elevadas de la hormona fria. En trabajos posteriores, este hibridoma sera sometido a un analisis mas profundo con vista a su posible aplicacion en sistemas inmunoenzimaticos y ademas realizaremos el estudio de focalizacion isoelectrica de todos los anticuerpos obtenidos, lo cual constituye otro criterio fuerte a favor de la monoclonalidad de un anticuerpo (19) al aparecer estos en un gel de isoelectroenfoque como un conjunto discreto de tres a cinco bandas que forman una agrupacion en una zona especifica de pH.

Las primeras aplicaciones de los inmunoensayos para la determinacion de LH fue mediante el empleo de metodos isotopicos, los cuales, mediante el perfeccionamiento de la calidad y disponibilidad de los antisueros fueron ganando cada vez mas en especificidad y sensibilidad (15, 20).

Sin embargo el uso de isotopos posee varios problemas como su corta vida media, equipamiento complejo para su lectura y lo que es mas importante aun el dano potencial que puede ocasionar al personal que labora con el.

Aqui presentamos el desarrollo de un nuevo metodo enzimatico tipo "sandwich" que utiliza un anticuerpo policlonal como recubrimiento y un AcM (LH8 y LH12) como segundo anticuerpo, seleccionados estos ultimos por sus resultados de ka y especificidad.

Las curvas de los AcMs LH8 y LH12 utilizados a diferentes concentraciones resultaron en sentido general muy semejantes entre si aunque se escogieron para trabajar las concentraciones de 20 y 10 uL/mL respectivamente por presentar mejor desplazamiento. Al realizar la comparacion entre los distintos anticuerpos observamos que si bien las diferencias no son muy notorias, el AcM LH8 mostro cierta superioridad en la discriminacion entre los valores mas bajos de estandar de LH (Figura 8). Estos anticuerpos fueron capaces de detectar la LH en un rango entre 0,7 y 100 mU/mL y una sensibilidad de 0,2 mU/mL.

Figura 8. Sistema inmunoenzimatico utilizando el anticuerpo monoclonal LH8 y LH12.

Los niveles de sensibilidad alcanzados en este sistema son superiores a los del RIA reportado por nuestro laboratorio (21); por otro lado esta sensibilidad es superior a otros ELISAs reportados recientemente (22) el cual es desde el punto de vista metodologico muy semejante a nuestro ensayo.

Esta sensibilidad excede a la requerida para realizar las determinaciones sericas de LH, por lo que consideramos que este ensayo podria ser adaptado al estudio de las concentraciones urinarias de la misma (23), lo cual permitiria hacer menos costoso el proceso de toma de muestra y lograr que esta sea menos agresiva para el paciente, sobre todo si tenemos en cuenta que los niveles de estas hormonas exhiben un patron ciclico y que su estudio generalmente requiere la toma de sangre a intervalos frecuentes, principalmente cuando estas determinaciones estan encaminadas al estudio de la pareja infertil o al control de la fertilidad (24).

El conocimiento de que la declinacion del pico de LH, que ocurre tras la ovulacion, demora 24 h mas en la orina respecto a los niveles sericos, constituye otro aspecto a favor de las determinaciones urinarias de LH (25). Ademas, debido a que las concentraciones sericas de la hormona son tambien afectadas por su metabolismo y por la velocidad de su aclaramiento renal, su determinacion en la orina es importante para la total comprension de la fisiologia de la LH (26).

Las lineas de hibridomas obtenidas mostraron cumplir con los requisitos de especificidad deseada para su potencial utilidad junto a un anticuerpo policlonal en el desarrollo de un sistema inmunoenzimatico rapido y sencillo.

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