Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 111-113

Cuantificacion de proteina adsorbida en gel de hidroxido de aluminio

Jose Luis Marcelo, Alfonso Acosta, Lourdes Costa, Jorge L Lopez, Makis Torres, Asterio Cruz, Maribel Vega y Dayami Amador

Subdireccion de Calidad, Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana 10600, Cuba.

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Introduccion

La produccion de la vacuna antihepatitis B por via recombinante cuenta con un sistema de controles analiticos, tanto a la materia prima como al producto final, que garantiza que la misma sea liberada manteniendo sus tres principales caracteristicas: eficacia, seguridad e inocuidad. A la par del desarrollo de nuevos productos, las regulaciones en materia de productos biologicos son cada dia mas estrictas, lo que ha traido consigo la busqueda de nuevos y mas sensibles metodos y procedimientos para dar cumplimiento a las mismas, siendo una de las principales, la determinacion de la concentracion de la proteina de interes en el preparado final (1).

Debido a la complejidad de la determinacion de la proteina unida al gel, pocos son los trabajos que se reportan en la literatura sobre este tema. Golovina (2) emplea polietilenglicol para determinar proteinas adsorbidas sobre Sepharosa, con lectura a 280 nanometros, pero la sensibilidad es limitada. Koelsch (3) ha desarrollado la determinacion por medio de la reaccion de iones cobre con dietilditiocarbamato, en proteinas inmovilizadas en geles de agarosa, con la desventaja de no poder ser usado con matrices que formen complejos con iones cobre. El ensayo de ninhidrina, es otro de los mas recientes metodos empleados para peptidos o proteinas asociadas al adyuvante, con muy buenos resultados, excepto en presencia de liposomas (4). El ensayo de Kjeldahl, en su variante de micrometodo (1), es otra de las vias utilizadas, con las desventajas de las interferencias causadas por la presencia de nitrogeno en muchas de las soluciones tampon que se emplean, asi como de la disponibilidad del equipamiento.

El objetivo del presente trabajo consistio en establecer un procedimiento analitico que permita determinar la cantidad de proteina contenida en la vacuna cubana antihepatitis B, y que permita el empleo de procedimientos ampliamente reconocidos y validados, como son la desorcion del antigeno (5) y la cuantificacion de proteinas por Lowry (6), de forma tal que garantice su sencillez y reproducibilidad, parametros indispensables a tener en cuenta para el establecimiento del metodo en el control del producto final.

Materiales y Metodos

Se utilizo como control un lote de vacuna, previamente analizado y liberado, con una concentracion de 20 g de antigeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) por cada mililitro de gel de hidroxido de aluminio.

El procedimiento desarrollado consta de tres pasos fundamentales:

Desorcion

Con la finalidad de separar la proteina que esta unida al gel para su posterior cuantificacion. Se emplearon 5 mL de vacuna, de acuerdo al protocolo desarrollado por Izquierdo et al (5), y se tomo el sobrenadante donde se encontraba la proteina.

Desalinizacion

Este es un paso necesario para separar la proteina de las sustancias interferentes presentes en los tampones de desorcion, las cuales afectan el ensayo de cuantificacion final de la proteina por Lowry.

Las condiciones de trabajo fueron las siguientes:

Se tomo 1 mL del sobrenadante obtenido en el paso anterior y se aplico en una columna PD-10, equilibrada con el tampon de elucion de fosfato a pH 6,7. Se colecto la primera fraccion eluida que contenia la proteina de interes (Figura 1).

Figura 1. Perfil cromatografico obtenido a partir de las muestras desalinizadas. P: placebo; 1, 2, 3 y 4 corresponden a las fracciones de proteina de los adyuvados de 5, 10, 15 y 20 g/mL.

Debido a que la muestra en el paso de desorcion es sometida a condiciones drasticas de temperatura, que provocan cambios estructurales y conformacionales en la molecula, no fue posible realizar su cuantificacion por lectura de la absorbancia a 280 nm ni por un metodo ELISA. Para la cuantificacion del antigeno fue necesario emplear el metodo de Lowry.

En cada ensayo se utilizo como blanco una muestra de placebo, la cual recibio el mismo tratamiento que las restantes.

Resultados y Discusion

Estudio de identificacion del antigeno

Las muestras con 22, 25 y 50 g/mL desalinizadas se aplicaron a una columna de cromatografia liquida de alta resolucion de gel filtracion (HPLC-GF) TSK G 5000PW (7.5 d.i. x 600 mm) y se observo que en todos los perfiles cromatograficos se identifica la senal del HBsAg al eluir la muestra, en el tiempo de retencion especificado, segun Costa et al. (7), lo que demostro que las fracciones a las que se les determino proteina correspondian al HBsAg recombinante.

Estudio de la reproducibilidad

Se procesaron 10 muestras de la vacuna control durante dias diferentes, cada una por duplicado y se obtuvo un valor medio de 20,7 g/mL, con una desviacion estandar de 2,1 y un coeficiente de variacion del 10,2 %. El valor medio coincide con lo reportado por el metodo microkjeldahl entre 21 y 23 g/mL en una evaluacion internacional efectuada a la vacuna, utilizando otros lotes (Laboratorios Boryung, Corea, 1994). El coeficiente de variacion del metodo puede considerarse aceptable, si se tienen en cuenta los bajos niveles de proteina y los diferentes pasos previos a la cuantificacion de la misma.

Estudio de exactitud e imprecision del ensayo

Para estudiar la exactitud del metodo se realizaron 5 adyuvaciones experimentales de 5, 10, 15, 20 y 25 g de antigeno por mL de gel codificadas y analizadas a ciegas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1. Como complemento de este estudio se incluyeron tres adyuvaciones experimentales de 22, 25 y 50 g/mL respectivamente

Tabla 1. Resltados obtenidos para muestras de concentracion conocidas.*

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Valor esperado ( g/mL)    Valor obtenido ( g/mL)   CV (%)   %
recuperacion
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 5                             4,1                  51             81
10                             9,0                  17,6           90
15                            14,6                  19,4           97
20                            20,2                  10,4          101
25                            24,6                   5,5           98
22                            22,5                    -           102
25                            23,9                    -            95,6
50                            58,4                    -           117
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Se encontro una buena correlacion entre los valores esperados y obtenidos para este experimento, con un coeficiente de 0,998 y una respuesta lineal que corresponde a la ecuacion de una recta Y = 1,04X - 0,12.

Empleando los resultados obtenidos se construyo un grafico de imprecision del ensayo (Figura 2), cuyos resultados corroboran los obtenidos para la muestra de control (coeficiente de variacion de alrededor del 10 % para una concentracion de 20 g de proteina). Se puede observar que a medida que aumenta la concentracion de proteina, se obtiene una mejor precision en el ensayo y que con valores inferiores a 10 g la imprecision del mismo es muy alta.

Figura 2. Grafico de imprecision del metodo

Se hizo una curva de calibracion de masa contra senal, de manera que cada valor de masa equivaliera a 5 mL del adyuvado. La pendiente obtenida fue de 0,00074. Para cada punto de la curva se calculo la varianza de la senal y se comprobo homocedasticidad por medio de la prueba de Barttlett. Se promediaron las varianzas y se obtuvo la desviacion estandar general (DesvStG) a traves de su raiz cuadrada. La sensibilidad analitica (SA) se obtuvo por la siguiente expresion:

SA={{DesvStG} OVER {Pendiente}} OVER {V}

Se determino la sensibilidad analitica en el punto de 20 g/mL usando la desviacion estandar correspondiente al mismo y fue de 3 g, lo que permitio un nivel de deteccion adecuado de la concentracion a medir y por tanto, disponer de un buen nivel de sensibilidad en la determinacion.

Comprobacion del procedimiento en lotes de adyuvado y/o envase

Se procesaron 21 muestras que previamente habian sido liberadas y que cumplian con todos los requerimientos analiticos para el estudio y los resultados obtenidos muestran una media de 20,2 g/mL, con valores extremos entre 17,1 y 23,3 g/mL respectivamente.

Estos valores corresponden con lo esperado (20 g/mL). Teniendo en cuenta que la sensibilidad analitica del metodo es de 3 g, como se mostro anteriormente, la concentracion de las muestras debe oscilar alrededor de este intervalo.

Los resultados obtenidos en este experimento demuestran la consistencia del proceso de adyuvacion y por consiguiente, de la calidad del producto analizado.

Conclusion

Se cuenta con un metodo sencillo, sensible y reproducible para la determinacion cuantitativa de proteina en la vacuna antihepatitis B, el cual ha sido introducido como tecnica de control del contenido de la proteina al producto final, en el proceso de produccion de la vacuna antihepatitis B recombinante.

El procedimiento fue aprobado por las autoridades sanitarias nacionales y permite cumplimentar con los requisitos exigidos por la Organizacion Mundial de la Salud en materia de produccion de productos recombinantes.

Referencias

1. Technical Reports Series 1989;786. World Health Organization.

2. Golovina TO, Cherednikova T, Mevkh AT. Anal Biochem 1977;83:778-781.

3. Koelsh R, Marquardt I, Hanson H. Anal Biochem 1975;66:556-567.

4. Brewer JM, Roberts CW, Stimson WH, Alexander J. Accurate determination of adjuvant-associated protein or peptide by ninhydrin assay. Vaccine 1995;13(15):1441-1444.

5. Izquierdo M, Rodriguez O, Santiago A, Pineda J, Pozo C, Gutierrez D et al. Metodo para la comprobacion de adsorcion y desorcion de la vacuna contra la hepatitis B. Biotecnologia Aplicada 1993;10(2):105-106.

6. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.

7. Costa L, Moya G, Gonzalez EM, Caballero A, Falcon V, Vega M. Determinacion de la pureza y homogeneidad molecular del Antigeno de Superficie Recombinante de la Hepatitis B por HPLC-GF. Biotecnologia Aplicada 1994; 11(1):86-90.

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