Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 120-121

Nuevas alternativas para la producci¢n de estreptoquinasa recombinante

Luciano Hernandez Marrero, Natacha Perez Rodriguez, Diana R Orta Jacobo, Ernesto Urrutia Valdes, Yamila Torres Reyes y Vivian Pujol Garcia

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana C.P. 10600, Cuba.

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Introduccion

La estreptoquinasa recombinante es una proteina obtenida por la tecnologia del ADN recombinante (1), utilizada eficientemente como agente trombolitico en la terapia de diferentes afecciones como el infarto agudo de miocardio (2), la trombosis venosa profunda entre otras, que se encuentran entre las principales causas de muerte de los paises en desarrollo.

El mecanismo de accion de la estreptoquinasa natural, y sus propiedades fisicoquimicas (3, 4) fueron la base para el estudio de la molecula recombinante y el desarrollo de un proceso de purificacion. La estreptoquinasa puede ser purificada por afinidad utilizando su capacidad de formar un complejo estequiometrico con el plasminogeno humano (5), a traves de su carga empleando intercambiadores ionicos (6) o sistemas que logran una separacion diferencial de proteinas en base a sus propiedades hidrofobicas (7).

Para el proceso de purificacion de productos farmaceuticos es necesario, ademas de tener en cuenta elementos de escalado como: carga del gel, velocidad lineal, y dimensiones de la columna (7), que el proceso responda a las exigencias de pureza de la preparacion, la eliminacion de contaminantes proteicos y endotoxinas, ademas de conservar las propiedades biologicas de la proteina en cuestion.

Con este trabajo se modifica la tecnologia inicial de purificacion (cambio de la cromatografia de intercambio ionico por hidrofobicidad) y se mantiene el procesamiento continuo y rapido en esta etapa, se garantiza la calidad de la materia prima activa y se reducen los costos de produccion.

Adicionalmente se valoraron nuevas alternativas para mejorar y optimizar el proceso de liofilizacion de la estreptoquinasa recombinante.

El objetivo fundamental de estos experimentos fue obtener un proceso que permitiera separar de forma efectiva la estreptoquinasa recombinante de las proteinas contaminantes de Escherichia coli.

Materiales y Metodos

El material inicial fue estreptoquinasa recombinante semipura despues de dos pasos cromatograficos en gel filtracion e intercambio ionico.

Se controlaron los parametros a escalar: velocidad lineal, carga y dimensiones de la columna.

Se aplico la proteina en una solucion tampon de sulfato de amonio 0,86 M en Tris-HCl 20 mM pH 8,5. geles cromatograficos utilizados: TSK-Butilo (TosoHaas) y DEAE-sefarosa (Pharmacia).

De forma escalonada se redujo la interaccion hidrofobica proteina-ligando mediante la disminucion de la molaridad de la solucion inicial de sulfato de amonio y con el fin de separar la estreptoquinasa recombinante de sus contaminantes.

A continuacion se realizo un intercambio ionico con el proposito de eliminar endotoxinas y concentrar la proteina eluida.

Los analisis realizados a las muestras fueron: proteina, segun el metodo de Bradford (8), pureza mediante inmunodot y electroforesis de proteina en gel de SDS-poliacrilamida (9) y actividad biologica por la tecnica del sustrato cromogenico S-2251(10).

Para la optimizacion del proceso de liofilizacion se estudio el efecto de las temperaturas fundamentales en el proceso de liofilizacion. Las variables medidas fueron actividad biologica, porciento de humedad residual y tiempo total del ciclo.

Resultados y Discusion

La nueva alternativa para la purificacion, de la estreptoquinasa recombinante se basa en la combinacion de un paso cromatografico por interacciones hidrofobicas y una cromatografia de intercambio ionico, lo cual permitio obtener un producto de alta pureza con las caracteristicas requeridas para su aplicacion en humanos.

La cromatografia por interaccion hidrofobica permitio la eliminacion de contaminantes de E. coli presentes en el material inicial, mediante una separacion diferencial basada en la hidrofobicidad de la estreptoquinasa respecto a las proteinas del hospedero presentes en la preparacion (Tablas 1 y 2).

Tabla 1. Primer experimento: combinacion de hidrofobicidad e intercambio ionico. Elucion con un gradiente de sulfato de amonio del 40 al 0 %.

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Muestra corrida     Volumen   Proteina  Actividad  Recobrado  Contaminantes
en TSK-butilo.        (L)      total    especifica     (%)       (%) 
                               (mg)     (UI/mg)
---------------------------------------------------------------------------
M. inicial           16,8      15100     83404         -        2,5 %
Lavado 40 %          13,0       5630       -           -         -
Lavado 20 %           6,6       5850     60046        46,1 %    0,2 %
Lavado 15 %           3,0        852     53628         6 %      0,14 %
Lavado 10 %           2,0        380     37757         2 %      1,18 %
Lavado 0 %            2,0        490       -            -       31,1 %
---------------------------------------------------------------------------
Muestra corrida     Volumen   Proteina  Actividad  Recobrado  Contaminantes
en DEAE-Sefarosa.     (L)      total    especifica     (%)        (%)
                                (mg)    (UI/mg)    
---------------------------------------------------------------------------
M. inicial           11,6        7082     50477         -        0,5 %
Elusion               1,9        6190     64995       87,4 %     0,35 %
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Tabla 2. Segundo experimento: combinacion de hidrofobicidad e intercambio ionico. Elucion con un gradiente de sulfato de amonio del 20 al 0 %.

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Muestra corrida     Volumen   Proteina  Actividad  Recobrado  Contaminantes
en TSK-butilo.        (L)      total    especifica     (%)        (%)
                                (mg)    (UI/mg)    
---------------------------------------------------------------------------
M. inicial           19,5      16399     75546          -       1,33 %
Lavado 20 %           6,3       7364     79110         45 %     0,16 %
Lavado 15 %           2,8        845     74218          5 %     0,18 %
Lavado 10 %           2,8        750       -          4,5 %         
---------------------------------------------------------------------------
Muestra corrida     Volumen   Proteina  Actividad  Recobrado  Contaminantes
en DEAE-Sefarosa.     (L)      total    especifica     (%)        (%)
                                (mg)    (UI/mg)    
---------------------------------------------------------------------------
M. inicial           11,9       8959       -            -         -
Elusion               1,5       7120     87854        79,5%      0,3 %
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El producto se obtiene con un nivel de pureza mayor del 99 %.

El intercambiador ionico a continuacion del paso de separacion por hidrofobicidad permite la realizacion de lavados para eliminar endotoxinas existentes en el material, con lo que se obtiene la proteina con las especificaciones requeridas de: pureza, actividad especifica, apirogenicidad y concentracion para ser utilizada en la formulacion final del producto inyectable.

El escalado de este proceso productivo y la estabilizacion de la produccion a niveles de hasta 4 000 dosis mensuales,permitio reducir el costo de produccion en un 23,6 % con respecto al proceso establecido anteriormente. El proceso de escalado se realizo acorde con las condiciones de Buenas Practicas de Fabricacion establecidas a nivel internacional para este tipo de producto.

La optimizacion del proceso de liofilizacion de la estreptoquinasa recombinante, se realizo primero a escala piloto y luego a escala industrial. El incremento es de una liofilizadora de 20 Kg de hielo a una de 140 Kg, permitio lograr una reduccion del tiempo de 20 h en la escala piloto y 18 h en la industrial, lo que significa un 52,38 % de ahorro energetico ademas de aumentar la capacidad de produccion.

Se han realizado 15 lotes de producto final bajo estas condiciones y es aplicable a las cuatro presentaciones del producto.

Agradecimientos

Agradecemos la colaboracion prestada a este trabajo de: Jorge Sotolongo Pena, Publio Rodriguez Guzman*, Julieta Camino Corona, Aleydis Gomez Rios, Saul Alburquerque Perez, Ulises Penalver Lopez, Ristofen Alfonso Napoles, Ruben Bosch Garrido, Alexander Hernandez de la Paz, Libert Tamayo Dickinson, Diusvel Cartaya Aguilar, Yohima Valdes Nunez, Ernesto Olazabal Toledo, Juan Carlos Quesada Pena, Benito Castillo Rios, Mayra Wood Duque, Erney Cardona Vega, Leonardo Pacin Olivares, Miriela Gil Mena, Alberto Agraz Fierro, Luis Herrera Martinez, Yamila Martinez Cuellar, Marisol Cruz Diaz, todos del Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, Ciudad de La Habana, Cuba.

* EPB "Carlos J. Finlay", Ciudad Habana, Cuba.

Referencias

1. Estrada MP, Hernandez L, Perez A, Rodriguez P, Serrano R, Rubiera R et al. High level expression of streptokinase in Escherichia coli. Biotechnology 1992;10: 1138-1142.

2. Hernandez L, Rodriguez P, Serrano R, Munoz E, Estrada MP, de la Fuente J. Recombinant streptokinase for the treatment of thrombotic disorders. Annals New York Academy of Science 1992;667:424-427.

3. Nagendra K, Reddy N, Markus G. Mechanism of activation of human plasminogen by streptokinase. J Biol Chem 1972;247(6):1683-1691.

4. Radek JT, Castellino FJ. Conformational properties of streptokinase. J Biol Chem 1989;264:9915-9922.

5. Rodriguez P, Hernandez L, Munoz E, Castro A, de la Fuente J, Herrera L. Purification of streptokinase by affinity chromatography on immobilized acylated human plasminogen. BioTechniques 1992;12(3):424-427.

6. De Renzo EC, Sutteri PK, Hutchings BL, Bell PH. Preparation and certain properties of highly purified streptokinase. J Biol Chem 1967;242(3):533- 542.

7. Sakihama N, Ohmori H, Sugimoto N, Yamasaki Y, Oshino R, Shin M. Toyopearl HW-65 C: Ammonium sulfate as a new column chromatographic adsorbent for enzyme purification. J Biochem 1983;93:129-134.

8. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 1976;72:248-254.

9. Laemli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the Bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.

10. Hernandez L, Rodriguez P, Castro A, Serrano R, Rodriguez MP, Rubiera R et al. Determinacion de actividad estreptoquinasa utilizando un ensayo. Biotecnologia Aplicada 1990;7(2):153-160.

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