Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 124-125

VACOLI^MR: vacuna recombinante contra la colibacilosis porcina. Optimizacion del proceso productivo y su evaluacion en condiciones de campo

Idania Wong Padilla,^1 Eddy Bover,^1 Roberto Basulto,^1 Susset Valderrama,^1 Marbel Ramos,^1 Nemecio Gonzalez,^1 Manuel Exposito,^1 Ruthdalys Segura,^1 Eladio Salazar,^1 Lesvia Calzada,^1 Ramon Hernandez,^1 Ricardo Serrano^2 y Delmiro Sanchez^1

^1 Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 387, Camaguey, Cuba.
^2 Division de Estreptoquinasa, Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana CP 10600, Cuba.

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Introduccion

La Escherichia coli no patogenica es un habitante comun de la flora intestinal de los mamiferos y participa junto con otras bacterias en el sistema ecologico del intestino. Sin embargo, la E. coli patogenica se caracteriza por ser la causante de severas afecciones intestinales y extraintestinales, como la pyelonefritis, las diarreas, la meningitis y otras (1, 2). Hoy, nuestro pais cuenta con una vacuna recombinante (3) preventiva contra la enterotoxicosis neonatal y post-destete, la cual en ensayos de campo redujo la morbilidad hasta el 2,7 % y la mortalidad hasta el 1,2 % en las crias y el 0,6 % en las precebas. El presente trabajo tiene como objetivo optimizar el proceso de fermentacion y purificacion del antigeno recombinante K88 ab, asi como realizar un estudio de campo para determinar el beneficio economico que reporta la vacunacion con VACOLI^MR.

Materiales y Metodos

El proceso fermentativo de obtencion del antigeno K88 ab se realizo en medio MINCA; (glucosa 1,1 g/L, extracto de levadura suplentado hasta 10 g/L, hidrolizado de caseina 1 g/L, dihidrogeno fosfato de potasio 1,36 g/L, hidrogeno fosfato disodio 8,06 g/L, sales trazas 1 mL/L y ampicillina 100 g/mL). Las condiciones de fermentacion, fueron; en un fermentador (Marubishi BE, Japon) de 5 L de volumen efectivo, la temperatura 37 C, pH 7.2, agitacion a 250 rpm y el flujo de aire se redujo de 1 vvm (variante 1), hasta 0,2 vvm (variante 2).

La optimizacion de la etapa de purificacion consistio en la incorporacion y sustitucion de algunos pasos del proceso. El proceso de purificacion anterior incluia una extraccion con 2 M de tampon de urea y fosfato 50 mM a pH 7,2; seguido de una precipitacion de las proteinas del sobrenadante a 4 C con sulfato de amonio al 60 % durante 12 h y de una desalinizacion por columna en una matriz de G-25. Finalmente se envasaba el sobrenadante de forma esteril.

En el nuevo proceso se estudiaron los pasos de lavado y extraccion, con tres soluciones tampones diferentes; (a) TF (tampon fosfato) 50 mM con 0,9 % de NaCl y pH 7,2; b) TF 50 mM con 2 M de urea y pH 7,2; c) TF 50 mM a pH 7,2. Se incorporo el paso de precipitacion isoelectrica de K88 ab a pH 5.2, con HCl al 10 %. Cada paso fue seguido de una centrifugacion a 7 000 rpm durante 60 min. El proceso finalizo con una resuspension de la proteina precipitada con TF, 50 mM a 4 C, seguido de una centrifugacion a 7 000 rpm durante 30 min, se envaso el sobrenadante de forma esteril y se adiciono formalina al 0,5 % v/v.

La concentracion de proteinas se determino por el metodo de Lowry (4), la pureza se establecio por electroforesis con SDS (5) y se utilizo un ELISA tipo Sandwich (6) para la determinacion de la concentracion de antigeno.

El ensayo de campo de la vacuna se realizo en todas las granjas pertenecientes a la Empresa Porcina de la Provincia de Camaguey, efectuandose la vacunacion durante 12 meses consecutivos. Los resultados de morbilidad, mortalidad y beneficio economico, se compararon con el promedio obtenido en los ultimos tres anos anteriores a la vacunacion.

Resultados y Discusion

Al comparar los resultados obtenidos entre las fermentaciones con las dos variables de flujo de aire se pudo apreciar que la reduccion de oxigeno causo un incremento en la expresion del antigeno K88 ab de 27 mg/L hasta 160 mg/L.

El estudio de extraccion con las tres soluciones tampones, asi como la variacion del pH de los mismos durante la precipitacion, mostro que era posible obtener mayor porciento de antigeno en relacion con las proteinas totales, con el empleo del tampon fosfato 50 mM a pH 5,2 (Tabla 1).

Tabla 1. Resultados de la purificacion con diferentes soluciones tampones y valores de pH.

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                      Extraccion
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Solucion tampon       a        b
TF + 0,9 % NaCl     44,7     69,5
TF + 2 M urea       45,4     76,4
TF. 50 mM           47,4     77,9
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a: % de antigeno K88 ab con relacion a las proteinas totales, extraido por calor
b: % de antigeno K88 ab con relacion a las proteinas totales, precipitado con 10 % de HCl

Finalmente el proceso optimizado consta de un lavado de la biomasa con TF 50 mM a pH 7,2, una extraccion con la misma solucion tampon 20 min a 60 C, una precipitacion isoelectrica con HCl al 10 % hasta llegar a pH 5,2; cada paso seguido de una centrifugacion a 7 000 rpm durante 60 min. El proceso finaliza con una resuspension del precipitado con TF 50 mM a 4 C, seguido de una centrifugacion a 7 000 rpm durante 30 min, se le anade formalina hasta una concentracion de 0,5 % v/v y se realiza su envase esteril.

Los resultados de la prueba de campo fueron satisfactorios. En la Tabla 2 se muestran las perdidas que ocasiono, en la provincia de Camaguey, la colibacilosis porcina antes y despues de la vacunacion.

Tabla 2. Reultados de la morbilidad y mortalidad antes y despues de la vacunacion con VACOLI^MR. Perdidas economicas.

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Tiempo de  Anos   Morbilidad (%)   ^Mortalidad (%)  Perdidas economicas 
vacunacion       crias + precebas  crias  precebas  por E. coli (promedio)
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Antes      1991       10            6        3    
           1992       13            7        4          1 050 810 USD
           1993       8,3           2,8      1,6          835 820 pesos
Despues    1994       4,5           2,1      0.6          136 670 USD
           1995       0,9           0,3      0             25 579 pesos
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El gasto promedio se redujo, obteniendose un beneficio economico para la provincia de 914 140 dolares mas 810 240 pesos. Esto representa una recuperacion del 87 % de la moneda convertible y el 97 % de la moneda nacional en la produccion porcina en Camaguey.

La aplicacion de Vacoli^MR en condiciones de campo proporciono ademas una disminucion de la morbilidad por E. coli hasta 0,9 % en las categorias de crias mas precebas asi como de la mortalidad hasta 0,3 % en crias y 0 % en precebas, ambas reportadas al segundo ano de comenzado el proceso de vacunacion.

Referencias

1. Korhoen TK, Vaisanen-Rhen V, Rhen M, Pere A, Parkkinen J, Finne J. Escherichia coli fimbriae recognizing sialyl galactosides. J Bacteriol 1984;159:762-766.

2. Morris JA, Sojka WJ, Ready RA. Serological comparison of the Escherichia coli strains for the F(Y) and Att25 adhesins implicated in neonatal diarrhoea in calves. Res Vet Sci 1985;38:246-247.

3. Wong I, Bover E, Ramos M, Gonzalez N, Exposito M, Segura R et al. Eficacia en condiciones de campo de una vacuna recombinante contra la colibacilosis porcina. Biotecnologia Aplicada 1996;13:16-19.

4. Lowry OH, Rosebrough J, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin-phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.

5. Laemmli UK. Cleavaje of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;277:680-685.

6. Borroto A, Basulto R, Moreno M, Silva R, Wong I, Bover E et al. Clonacion de las subunidades fimbricas K88 ab y K99 e identificacion de cepas de Escherichia coli enterotoxigenicas aisladas de cerdos enfermos. Biotecnologia Aplicada 1992;9:148-155.

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