Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 126-127

Nueva variante de purificacion a escala productiva de la materia prima activa de la vacuna contra la garrapata Boophilus microplus Gavac^R

Oscar Boue Gutierrez,^1 Karina Sanchez Manzano,^1 Grisel Tamayo Rodriguez,^2 Laura Hernandez Baquero^2 y Antonio Enriquez Mouriz^1

^1 Grupo Desarrollo Tecnologico.
^2 Division Gavac. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162. Ciudad de La Habana 10600, Cuba.
E-mail: gavac@cigb.edu.cu

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Introduccion

La proteina recombinante Bm86, expresada en la levadura Pichia pastoris, constituye la materia prima activa (MPA) de la vacuna Gavac^R (Heber Biotec, S.A., La Habana, Cuba) contra la garrapata Boophilus microplus, que ha resultado eficaz en el control de las poblaciones de esta especie de garrapatas en Cuba (1) y en varios paises de America Latina (2, 3).

La purificacion de la MPA en el proceso productivo se realiza en un solo paso, mediante una precipitacion salina de los contaminantes con sulfato de amonio al 25 % de saturacion (4). Debido a las ventajas que tiene este procedimiento, se selecciono como primera opcion para la purificacion de rBm86. No obstante, su aplicacion en 69 lotes a escala productiva represento perdidas irreversibles por baja pureza del orden del 19 % y de un 20 % por precipitacion de la proteina de interes.

Otra variante de purificacion, basada en la co-precipitacion isoelectrica de las proteinas contaminantes, fue estudiada y aplicada a escala productiva. En 42 lotes desarrollados no hubo perdidas por baja pureza, la cual aumento en un 15 % con un recobrado del 98 %. Esto represento un ahorro de un 20 % del costo de produccion de la vacuna.

Materiales y Metodos

La mezcla de proteinas que se utilizo para purificar la rBm86 fue obtenida como describen Canales et al. (4). Todos los reactivos utilizados fueron de calidad para analisis (Merck). La proteina recombinante Bm86 fue cuantificada utilizando un ensayo ELISA tipo sandwish (5). La determinacion de pureza fue realizada mediante densitometria laser a geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tenidas con azul de Coomassie, segun el metodo de Laemmli (6). El tamano de particula fue determinado mediante microscopia electronica (4).

Resultados y Discusion

Caracteristicas de rBm86

El punto isoelectrico de la particula de rBm86 fue hallado utilizando una curva de valoracion. Los metodos tradicionales, como el isoelectroenfoque o el cromatoenfoque, son imposibles de utilizar debido a la alta agregacion de la rBm86. El valor calculado por la curva de valoracion (4,5+/-0,07) difiere del punto isoelectrico teorico (5,47). Esto es logico, ya que este ultimo solo tiene en cuenta la secuencia de aminoacidos y no la distribucion de las cargas sobre la superficie de la particula de rBm86.

Durante la valoracion de rBm86 otra caracteristica importante fue observada. La proteina no precipito en todo el rango de pH estudiado, incluso en su punto isoelectrico. Sin embargo, al valorar una solucion que contenia a rBm86 impura, se observo un precipitado reversible. Este hecho indica que los contaminantes pueden ser precipitados solamente variando el pH del solvente, dejando soluble a la proteina de interes.

Alternativas de purificacion. Precipitacion acida vs salina

La estrategia para purificar rBm86 esta basada en la precipitacion de los contaminantes (mayoritariamente hidrofobicos) en la menor cantidad de pasos posibles y dejar soluble a la proteina de interes (hidrofilica), tomando siempre en cuenta el aspecto economico.

Una gran ventaja de la precipitacion salina con sulfato de amonio es que, por lo general, las proteinas se estabilizan en esa solucion. La alta concentracion salina evita la proteolisis, la accion bacteriana, ademas de las ventajas que ofrece tener un paso en que el producto se pueda dejar toda la noche. Sin embargo, cuando se purifica rBm86 por precipitacion salina con sulfato de amonio hay que tener en cuenta que la salinidad solo reduce la solubilidad por lo que nunca precipitan todas la proteinas. La pureza de rBm86 aumenta a medida que aumenta la concentracion salina, pero disminuye el recobrado (Figura 1). Esto trae como consecuencia que hay que llegar a un compromiso entre el grado de pureza obtenido y el recobrado de rBm86. Alrededor del 25 % saturacion con sulfato de amonio se encuentra el punto critico para el caso de rBm86.

Figura 1. Pureza y recobrado obtenido para rBm86 a diferentes concentraciones de sulfato de amonio.

En la precipitacion isoelectrica de los contaminantes de rBm86 existe un valor de pH (~5) en el que la pureza y el recobrado son maximos (Figura 2) evitandose las perdidas por precipitacion de la rBm86.

Figura 2. Pureza y recobrado para rBm86 contra la variacion del pH de la solucion.

Los resultados a escala productiva de la precipitacion isoelectrica a pH 6,04 (punto isoelectrico de la principal contaminante de rBm86) y a escala piloto, precipitando a pH 5, con respecto al metodo tradicional en cuanto a nivel de pureza y a tamano promedio de las particulas muestran una mejoria significativa (Tabla 1). Ademas de reducir a cero los rechazos, el nuevo metodo es operacionalmente simple, ahorra materias primas, materiales, electricidad, reduce de manera considerable la operacion de los equipos, aumenta considerablemente el recobrado, obteniendo valores de pureza elevados y estables, que incrementan significativamente la calidad de la MPA de la vacuna. Solo con la aplicacion de este nuevo metodo se ha disminuido en un 50 % los costos de produccion de la MPA y un 20 % de los costos de la vacuna Gavac^R.

Tabla 1. Comparacion entre todos los lotes producidos de rBm86 por ambos metodos.

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                      Salina*    pH 6,04*    pH 5,0**
                     -----------------------------------
Total lotes              69        38         14
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Pureza            
              Media      61        76         97
        Rechazo (%)      19         0          0
                  --------------------------------------     
Particulacion      
    Tamano promedio      19        21         26
      Recobrado (%)      80        98         98

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Referencias

1. Rodriguez M, Penichet ML, Mouris AE, Labarta V, Luaces LL, Rubiera R et al. Control of Boophilus microplus populations in grazing cattle vaccinated with a recombinant Bm86 antigen preparation. Veterinary Parasitology 1995;57:339-349.

2. Rodriguez M, Massard CL, da Fonseca AH, Ramos NF, Machado H, Labarta V and de la Fuente J. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine 1995;13:1804- 1808.

3. Lamberti J, Signorini A, Mattos C, D Agostino B, Citroni D, Bacos E et al. Evaluation of the recombinant vaccine against Boophilus microplus in grazing cattle in Argentina. In: de la Fuente J, editor. Recombinant Vaccines for the Control of Cattle Tick. Havana: Elfos Scientiae 1995:205- 227.

4. Canales M, Enriquez A, Ramos E, Dandie H, Soto A, Cabrera D et al. Large-scale production of the recombinant vaccine Gavac against cattle tick. Vaccine 1997;15:414-432.

5. Triguero A, Carpio E, Blanco R, Machado H, Rodriguez M, Enriquez A et al. Development of a sandwich ELISA with monoclonal antibodies generated against the recombinant Bm86 antigen. Biotecnologia Aplicada (In press).

6. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970;227:680-685.

Copyright 1997 Elfos Scientiae

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