Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 128-130

Montaje y validacion de un elisa para la cuantificacion de los niveles de proteinas de Escherichia coli en la estreptoquinasa recombinante

Niubel Diaz,^1 Marisol Cruz,^1 Ileana Rosales,^1 Asterio Cruz,^1 Dermin Perez,^2 Lourdes Costa,^1 Eliana Perez^1 y Luis Herrera^2

^1 Subdireccion de Calidad.
^S ubdireccion de Produccion. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162 Ciudad de La Habana, C.P. 10600, Cuba.

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Introduccion

La presencia de impurezas proteicas de la cepa hospedera en las proteinas farmaceuticas recombinantes pueden afectar la calidad bioquimica del producto o causar efectos adversos en los pacientes (1, 2), por lo que es necesario evaluar su contenido en el producto final. Los metodos para el analisis de la pureza, como la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y los cromatograficos, no se pueden emplear cuando se necesita detectar impurezas que comigran o coeluyen con el producto final y carecen de sensibilidad para detectar trazas. En este trabajo se describen los resultados obtenidos en el desarrollo y la validacion de un ELISA multiantigenico, capaz de cuantificar de forma precisa y especifica estos contaminantes.

Materiales y Metodos

Obtencion y caracterizacion de la preparacion de proteinas de Escherichia coli

Se obtuvo a partir de una corrida en blanco del proceso de produccion. Se partio de la cepa W3110 transformada con el plasmido, sin el gen que codifica para la estreptoquinasa recombinante, hasta la etapa de intercambio ionico negativo. La concentracion de proteinas se determino por el metodo de Lowry (3) y se analizo su perfil por una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5 % con SDS (4). Para detectar su presencia se realizo un Western-blotting segun el metodo descrito por Towbin et al (5), incubando la preparacion de proteinas de E. coli (pPEc) con un anticuerpo monoclonal contra la proteina recombinante (SK1, CIGB).

Obtencion de los anticuerpos policlonales contra la pPEc (anti- pPEc)

Se empleo el metodo de inmunizacion por cascada (6). Se evaluo el reconocimiento inmunologico de los antisueros mediante Western-blotting (5) y se evaluo el titulo de los anticuerpos por un ELISA indirecto semicuantitativo (6).

Los anti-pPEc se purificaron empleando un gel de sefarosa CL-4B activado con Br-Cn (Pharmacia) acoplado con la pPEc (7) y se conjugaron a peroxidasa de rabano picante (HRP) grado 1 (Sigma), por el metodo del periodato de sodio (8).

Procedimiento del ELISA multiantigenico

De forma general las placas de microtitulacion de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) fueron recubiertas con los anti-pPEc diluidos en tampon bicarbonato de sodio/carbonato de sodio 0,1 M (Merck) pH 9,6 y se bloquearon durante 1 h a 37 C con una solucion de PBS-Tween al 0,05 %. Las muestras se prepararon en la misma solucion de bloqueo y la pPEc se empleo como curva patron del ensayo. Luego de los corrientes lavados, se dispenso el conjugado previamente diluido en PBS-Tween al 0,1 % y se incubo 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Como cromogeno se utilizo ortofenilendiamina (Merck) al 0,04 % en tampon citrato, pH 5,5, 0,04 % de peroxido de hidrogeno 30 % (Fluka). La reaccion transcurrio en la oscuridad durante 20 minutos y se detuvo con 50 uL/pozo de H2SO4 2M (Merck). La lectura de la placa se realizo a 492 nm. La solucion de lavado empleada fue PBS-Tween al 0,05 %. El numero de lavados fue de 3, 6 y 8 entre pasos sucesivos.

Validacion del ELISA

Se analizaron los siguientes parametros:

- Limite de deteccion. Se comparo la media de la absorbancia a 0 ng/mL y a 6,25 ng/mL de pPEc, mediante un test de comparacion de medias, para 20 ensayos (9).

- Limite de cuantificacion. Se analizo mediante una prueba de hipotesis para demostrar que la media de la concentracion propuesta era igual al valor esperado.

- Precision intraensayo. Se evaluo mediante el coeficiente de variacion de los valores observados a esta concentracion, para 20 ensayos (10).

- Precision interensayo. Se tomaron tres muestras de estreptoquinasa recombinante e hicieron tres diluciones, cada una de ellas con cinco repeticiones, en los tres rangos de la curva de calibracion (alto, medio y bajo). Se analizo la repetibilidad, la reproducibilidad asi como los resultados interanalistas.

- Exactitud. Se determino mediante un experimento de recobrado, adicionando cantidades conocidas de la pPEc, en los tres rangos de la curva patron a tres muestras de estreptoquinasa recombinante. El porciento de impurezas esperado incluyo desde 0,25 % a 1,2 %. Los resultados obtenidos se procesaron mediante un analisis de regresion (10).

- Analisis de la linealidad de la dilucion. Se hicieron diluciones a tres muestras y se determino su concentracion (11, 12).

- Especificidad. Se prepararon curvas patrones de la pPEc en diferentes tampones B1: Tris-HCl 0,02 M, NaCl 0,2M; B2: Tris- HCl 0,02M; B3: Sulfato de amonio 0,17 M, Tris HCl: 0,02 M. Los resultados se procesaron mediante un analisis de varianza (ANOVA), tomando como referencia la curva preparada en el tampon del ensayo.

Obtencion y caracterizacion de la pPEc

La electroforesis de la pPEc, mostro la presencia de bandas en un rango de pesos moleculares, desde 14 kDa hasta 67 kDa, caracteristicas de la mayoria de las proteinas de la cepa hospedera, que podrian encontrarse como impurezas en el producto final. La seleccion de estas impurezas es importante para garantizar la sensibilidad y especificidad de los ELISA multiantigenicos al ser empleadas como inmunogenos, en la inmunopurificacion de los anticuerpos del ensayo y como curvas patrones contra las cuales se cuantifica la cantidad en los biofarmacos (1, 2). La ausencia de estreptoquinasa recombinante en la pPEc es una alternativa valida (2, 11-13) por evitar que durante la inmunizacion se produzcan anticuerpos dirigidos contra el producto (1).

Obtencion de los anticuerpos contra la pPEc

Se observo un incremento progresivo del reconocimiento inmunologico y del titulo de los antisueros anti-E. coli a la pPEc durante el esquema de inmunizacion en cascada. Anicetti (11) y Chen (12) emplearon metodos convencionales de inmunizacion para obtener los antisueros antiproteinas de E. coli, sin embargo el metodo de la cascada permite solucionar el fenomeno de competicion antigenica, que se presenta frecuentemente durante la inmunizacion con mezclas complejas (6).

Validacion del ELISA

Los resultados de la validacion se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de los parametros de la validacion.

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Parametros de validacion          Resultado
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Limite de deteccion             6,25 ng/mL, p = 0,00114
Limite de cuantificacion        12,5 ng/mL, p = 0,2
Precision intraensayo
(coeficiente de variacion)      Rango alto:  3-4 %
                                Rango medio: 3-4 %
                                Rango bajo:  8-11 %

                                        Analista A    Analista B
Precision interensayo
(coeficiente de variacion)  Rango alto    11-14 %       12-13 %
                            Rango medio   10-14 %       9-16 %
                            Rango bajo    14-17 %       17-20 %

Especificidad               No diferencias en la concentracion de las       
                                  proteinas de E. coli.
Linealidad                  Se mostro un valor constante de concentracion   
                                  para las tres muestras.
Exactitud                   Porcientos de recuperacion: entre 89 y 107 %.
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Los resultados obtenidos con el sistema propuesto concuerda con lo descrito en la literatura para los ELISA multiantigenicos. (11-13) que tienen una sensibilidad de 1 parte por millon y se pueden emplear siendo empleados para cuantificar trazas de impurezas en presencia de grandes cantidades de proteinas recombinantes. Con el desarrollo de metodos modernos de purificacion y el aumento en los porcientos de pureza de los biofarmacos recombinantes se requieren de metodos con un menor limite de deteccion. Nuestros resultados concuerdan con los criterios aceptados para los inmunoensayos que aceptan con coeficientes de variacion intraensayo menor que 10 % e interensayos menores que 20 % (11-13).

El ensayo fue especifico para la cuantificacion de las impurezas, lo que coincide con lo reportado, que los inmunoensayos, basados en la reaccion antigeno-anticuerpo deben ser altamente especificos capaces de detectar el analito de interes y no otros componentes dentro de la preparacion (14). Se demostro la linealidad de la dilucion demostrandose la condicion requerida de un exceso de anticuerpos dirigidos contra la mayoria de los componentes de la pPEc (1, 11, 12). El porciento de recobrado por ELISA obtenido coincide con los valores reportados entre 80 % y 120 %. La pendiente y el intercepto no fueron significativamente diferentes de 1 y 0, respectivamente (6, 11).

Conclusiones

Se obtuvieron los reactivos biologicos, no disponibles comercialmente. Los antisueros fueron capaces de reconocer todos los componentes dentro de las pPEc. Este ensayo es exacto, sensible especifico, preciso (coeficientes de variacion menores que el 20 %) y capaz de cuantificar los niveles de impurezas proteicas durante el proceso de purificacion de la estreptoquinasa recombinante y no los diferentes tampones donde se encuentra la estreptoquinasa recombinante.

Referencias

1. Anicetti VR. Improvement and experimental validation DNA products. ACS Symposium series Analytical Biotechnology, Washington 1990;7:127-140.

2. Eaton CL. Host cell contaminant protein assay development for recombinant biopharmaceutical. J Chromatography 1995;705:105-114.

3. Lowry, OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Andall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. Analytical Biochemistry 1951;193:265-275.

4. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly by bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.

5. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Nat Acad Sc USA 1979;76:4350-4354.

6. Anicetti VR, Simonetti MA, Blackwood LL, Jones AJS, Chen AB. Immunization procedures for E. coli proteins. Applied Biochemical and Biotechnology 1989; 22:151-168.

7. Ternynck TH, Avrameas S. Immunoenzymatic techniques In. Kazatchkine, M., Turner, M.W. Techniques in Immunology. Amsterdam: Elsevier, 1990;1:3- 18.

8. Nakane P. Preparation and standardisation of enzyme labelled conjugates. In:Immunoassays in the clinical laboratory. Eds.: Nakamura RM, Dito WR, Tucker ES, Liss AR. New York, 1974:81-87.

9. Rodbard D. Statistical estimation of the minimal detectable concentration (sensitivity) for radioligand assay. Analytical Biochemistry 1978;90:1-12.

10. Bernard Ostle. Estadistica Aplicada. Editorial Cientifico-Tecnica 1979.

11. Anicetti VR, Fehskens EF, Reed BR, Chen AB, Moore P, Geier MD, Jones AS. Immunoassay for the detection of E. coli proteins in recombinant DNA derived human growth hormone. J Immunol Met 1986;91:213-224.

12. Chen AB, Championsmith AA, Blanchard J, Gorrell J, Niepelt BA, Federici MM et al. Quantitation of E. coli protein impurities in recombinant human interferon T. App Biochemistry and Biotechnology 1992;36:137-152.

13. Garnick RL, Ross MJ, Baffi RA. In: Drugs Biotechnology Regulation Scientific Basis and Practices. Eds: Chiu YH, Gueriguian JL. Marcel Deker 23New York 1991:263-313.

14. Braggio S, Barnaby RJ, Grossi P, Cugola M. A strategy for validation of bioanalytical methods. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis 1996;14:375-388.

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