Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 2, 1997, pp. 135-139

Los postulads de koch y la neuropatia epidemica

*Jose de la Fuente, Maria Pilar Rodriguez, Fidel O Castro, Jorge Berlanga, Eileen Riego, Orlando Hayes, Alexis Musacchio y Ricardo Lleonart

Grupo para el Estudio de la Neuropatia Epidemica Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana, C.P. 10600, Cuba.

Recibido en julio de 1996. Aceptado en enero de 1997.

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ABSTRACT

During 1992-1993 Cuba was affected by an epidemic neuropathy (EN) classified as a new emerging disease. Toxic, nutritional and biological factors were argued to be involved in the etiology of the disease. The toxic-nutritional hipothesis was supported by some laboratory evidences and may acted as a predisposing cause for the disease. In the search for biological agents, samples of the cerebrospinal fluid from patients and controls were analyzed and a slow cytopathic effect was detected in 93 % of the patient s sample. The characterization of the virus indicated that it was a picornavirus and suggested that it was probably a mutated enterovirus or a new unidentified virus. Preliminary experiments suggested that the virus associated with the EN fulfilled the Koch's postulates. Our hypothesis is that the etiology of the EN could be related with nutritional deficits and stress that made the population more susceptible to the appearance of clinical symptoms because of the infection with a virus, responsible for the neurological injury through a probable autoimmune reaction against structures of the nervous system, that otherwise, would be asymptomatic. This paper is not intended to assay our hypothesis but rather to summarize our preliminary results and to promote scientific debate.

Key words: neuritis, picornavirus, enterovirus, monkey

RESUMEN

Durante 1991-1993 Cuba fue afectada por una epidemia de neuropatia (NE) con caracteristicas particulares que hicieron se clasificara como una nueva enfermedad emergente. Se sugirieron diferentes hipotesis sobre la etiologia de la enfermedad con la participacion de factores toxico-nutricionales y biologicos. La hipotesis toxico-nutricional fue respaldada por algunas evidencias de laboratorio y puede haber actuado como una condicion de base para la enfermedad. En la busqueda de agentes infecciosos dentro del cuadro de la epidemia, se analizaron muestras de liquido cefalo-raquideo de pacientes y controles sanos, y se detecto un efecto citopatico ligero en el 93 % de las muestras de pacientes. La caracterizacion de este virus permitio clasificarlo como un picornavirus y sugerir que se trataba posiblemente de un enterovirus mutante o un virus no descrito previamente. Experimentos preliminares permitieron sugerir que el virus asociado con la NE cumple con los postulados de Koch. Nuestra hipotesis es que la etiologia de la NE puede estar relacionada con deficits nutricionales y estres que hicieron a la poblacion mas susceptible a la aparicion de sintomas clinicos debido a la infeccion con un virus, responsable del dano neurologico que desencadeno posiblemente una reaccion de tipo autoinmune dirigida a estructuras del sistema nervioso y que, de otra manera, hubiese sido asintomatico. Este trabajo no pretende someter a prueba esta hipotesis, sino esbozarla a partir de los primeros resultados obtenidos y alentar al debate alrededor de un tema de tanta significacion.

Palabras claves: neuritis, picornavirus, enterovirus, mono

"Fijense como nos sorprendio el misterio de la neuropatia, cosa muy rara tambien, rarisima, y de todo eso recogimos bastante informacion, porque eran constantes las reuniones, los analisis y las pruebas. Sobre la marcha hubo que librar la guerra de la neuropatia, que aparecio de una manera rara en un lugar y despues por otro. Todavia guarda misterios...."

Fidel Castro Ruz (discurso pronunciado en la clausura del XI Foro de Ciencia y Tecnica el 21 de diciembre de 1996. Fuente: Granma, 24 de diciembre de 1996, pag. 5).

Los postulados

En 1884 el bacteriologo aleman Robert Koch definio un ensayo para probar que una determinada enfermedad es causada por un agente infeccioso (1, 2). Este ensayo, conocido como los Postulados de Koch, se ha convertido en una regla general para la investigacion biomedica.

Los postulados, segun los definio el cientifico aleman, mantienen que:

- El germen debe encontrarse creciendo o haber crecido en todos los pacientes.

- El germen debe aislarse y multiplicarse en el laboratorio.

- El germen purificado debe causar la enfermedad cuando se inocule en otro hospedero.

- El germen debe ser reaislado de los animales experimentalmente infectados.

- No obstante haberse demostrado su universalidad, varias enfermedades asignadas a virus como los virus lentos, el virus de la hepatitis C y el HIV-1 no cumplen con los postulados de Koch (3).

Una epidemia de neuropatia que produjo sintomas centrales y perifericos ocurrio en Cuba entre 1991 y 1993; hasta octubre de 1993 fueron reportados alrededor de 50 000 casos. La enfermedad fue nombrada como neuropatia epidemica (NE) y presento tres cuadros clinicos: uno puramente ocular (neuropatia optica), otro en forma de neuropatia periferica y casos mezclados. La caracterizacion clinica y epidemiologica de la enfermedad ha sido publicada con anterioridad (4). No se reportaron muertes y la incidencia de la enfermedad decrecio sustancialmente a partir de junio de 1993, fecha en que el Ministerio de Salud Publica comenzo a suministrar polivitaminas orales a toda la poblacion.

Se sugirieron diferentes hipotesis sobre la etiologia de la enfermedad con la participacion de factores toxico-nutricionales y biologicos. La hipotesis toxico-nutricional fue respaldada por algunas evidencias de laboratorio (4, 5) y puede haber actuado como una condicion de base para la enfermedad. Las evidencias sobre la participacion de agentes infecciosos en la enfermedad fueron apareciendo desde los comienzos del estudio (6-12).

Aunque varios hallazgos clinicos en la NE fueron consistentes con cuadros de neuropatias toxicas o metabolicas, otros evidenciaron el compromiso de pequenas fibras nerviosas en adicion a las fibras largas de mielina, comunmente involucradas en las neuropatias toxico-metabolicas. Adicionalmente, la epidemia cedio sin cambios en los factores de riesgo que fueron identificados en los estudios de campo (disponibilidad de alimentos y habito de fumar (5)), sugiriendo que otros factores pueden haber jugado un papel en la epidemia.

La disminucion en los casos de la epidemia puede explicarse por la eliminacion del agente predisponente (con la administracion de las vitaminas orales por ejemplo), por la eliminacion de susceptibles o por una combinacion de ambos factores.

Nuestra hipotesis es que la etiologia de la NE puede estar relacionada con deficits nutricionales (complejo de vitaminas B por ejemplo) y estres que hicieron a la poblacion mas susceptible a la aparicion de sintomas clinicos debido a la infeccion con un virus que, de otra manera, hubiese sido asintomatico.

El agente infeccioso

En la busqueda de agentes infecciosos dentro del cuadro de la epidemia, se analizaron muestras de liquido cefalo-raquideo (LCR) de pacientes y controles sanos. Se detecto un efecto citopatico (ECP) ligero en el 93 % de las muestras de pacientes y en el 9 % de los controles cuando las muestras de LCR se inocularon en lineas celulares derivadas de rinon de mono verde africano (6). La terapia con interferon alfa-2b recombinante (Heberon- alfaR; Heber Biotec S.A., Habana, Cuba) redujo el por ciento de LCR con ECP (6, 7). Se detectaron ademas por amplificacion de ADNc (RT-PCR) secuencias homologas a enterovirus en el 36 % (40/111) de los pacientes y en el 8 % (1/12) de los controles (8).

Las caracteristicas fundamentales de los virus aislados en la mayoria de los pacientes se describen en la Tabla 1.

Tabla 1. Caracterizacion de los virus aislados de pacientes con NE.

---------------------------------------------------------------------------
Caracteristica        IG-28/IG-32            CoxA9 (cepa Griggs)*    HSV-1*
---------------------------------------------------------------------------
ECP               Lento, 80 % dano celular  100 % efecto litico en     ND
                  despues de 6-10 dias de   1-2 dias de cultivo 
                  cultivo        

Placas virales    < 1 mm, circulares y      3-5 mm, circulares y      
ND
                  aparicion en 12-15 dias   aparicion en 4/5 dias    

Titulo viral      10^5-10^6 UFP/mL          10^7-10^9 UFP/mL           ND
   promedio 

Microscopia       Particulas esfericas no   Particulas esfericas no    ND
  electronica     envueltas con 28-30 nm,   envueltas con 28-30 nm, 
                  presencia de particulas   presencia de particulas
                  vacias                    vacias    

Densidad de           1,30 g/mL                1,34 g/mL               ND
flotacion en CsCl      

Tratamiento con   Resistente a pH 9,        Resistente a pHs 3-9       ND
 diferentes pHs   sensible a pH 3    

Resistencia al          NR                       R                     ND
calor en presencia 
de MgCl2 1 M    

Tratamiento con         NR                       R                     R
20 % de eter por 1 h   

Tratamiento con 1 %     NR                       R                     R
cloroformo por 1 h    

Tratamiento con 70-80    R                      NR                    ND
 g/mL hidrocloruro de 
guanidina   

Inmunohistoquimica con   P                       P                    ND
anticuerpos anti-CoxA9 
de tejidos de animales 
inoculados   
---------------------------------------------------------------------------

De estos analisis derivamos las siguientes reflexiones:

- El agente viral es un picornavirus.

- Presenta similitudes y diferencias con los enterovirus.

- Puede ser un enterovirus mutante o un virus nuevo.

- En el cuadro de la epidemia, el virus debe jugar el papel fundamental en el dano neurologico.

Al enfrentar los resultados obtenidos con los virus aislados de pacientes con NE a los postulados de Koch encontramos lo siguiente:

Postulado 1: el virus se encontraba en la mayoria de los pacientes con NE

1. Obtuvimos un 93 % de aislamientos virales en LCR de pacientes (6). Esto se considera sumamente alto para LCR. Adicionalmente, la posibilidad de sobrediagnostico durante la epidemia puede explicar en alguna medida la diferencia con el 100 %.

2. Todos los sueros estudiados tenian anticuerpos contra la proteina VP0 del C-47/IPK (aislamiento que presenta similitudes antigenicas con los aislamientos encontrados en la mayoria de los casos de NE (6,9,12)). Solo los sueros de los pacientes con NE mostraron anticuerpos tipo IgG y/o IgM/IgA contra la proteina VP1 del aislamiento C-47/IPK (9).

3. El hallazgo de un 9 % de ECP en los controles puede explicarse por las dificultades en seleccionar un verdadero control pues, como se demostro por estudios inmunologicos, el virus circulo en la poblacion sin que ello se correlacionara con la aparicion de sintomas clinicos (6, 9).

Postulado 2: el virus se multiplico in vitro y se caracterizo parcialmente.

1. Los resultados recogidos en la Tabla 1 sustentan esta aseveracion.

Postulado 3: resultados preliminares sustentan la posibilidad de que en monos verdes inoculados con los aislamientos IG-28/93 e IG-32/93 se reproduzcan algunos de los hallazgos hechos en pacientes con NE.

1. Los experimentos en monos verdes (Cercopithecus aethiops) se disenaron buscando un modelo experimental que reprodujera en lo posible las condiciones que segun nuestra hipotesis inciden de manera predominante en el desarrollo de la enfermedad: deficit vitaminico del complejo B (Vit), estres y presencia del agente infeccioso (V^+).

Los monos se sometieron a una dieta deficiente en tiamina y una vez comprobada la deplecion de vitamina B1, se inocularon con los aislamientos virales IG-28/93 o IG-32/93 o con solucion salina para el caso de los controles (V^-), y se sometieron, segun se muestra en la Tabla 2 (cuadriculas sombreadas), a los analisis de presencia del virus en el LCR varios dias despues de la inoculacion (dpi), anatomo-patologicos, geneticos, bioquimicos y de memoria a los 10 min, entre otros (manuscrito en preparacion).

Tabla 2. Diagrama de los analisis a los que fueron sometidos los monos segun el grupo experimental.

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Grupo         Virus en LCR    Patologia    Genetica    Bioquimica  Memoria 

experimental     (7 dpi)
Mono    
---------------------------------------------------------------------------
                              Vit^-/V^-
ST                 X                          X             X    
C16                               X            
4M                                X            
840                                                                    X

                              Vit^-/V^+
944                X              X           X             X          X
X5                 X              X            
825                X                                                   X

                              Vit^+/V^- (control sano)

1                                 X           X             X    
2                                             X             X    
--------------------------------------------------------------------------

Estos analisis arrojaron como resultados preliminares los recogidos en la Tabla 3 y permiten abordar un nuevo experimento que demuestre fehacientemente estos hallazgos.

Tabla 3. Resultados distintivos en los monos inoculados con los aislamientos virales.

---------------------------------------------------------------------------
Virus en LCR  Patologia        Genetica        Bioquimica    Memoria
(7 dpi)    
---------------------------------------------------------------------------
Negativos^a   Muerte neuronal  del indice de   Signos de    Perdida de la
              en la region     intercambio de  estres       memoria a los 
              mesaencefalica   cromatidas      oxidativo^ab 10 min^ab.
              -Vacualizacion   hermanas^a                   Se agrava
              severa del SNC   del numero de                despues de la
              y SNP            celulas en 2da               inoculacion^a
              Miocarditis      division y del   
                               indice mitotico^a             
---------------------------------------------------------------------------

Postulado 4: el virus se reaislo de monos verdes africanos infectados con el aislamiento IG-26/93.

En monos verdes africanos infectados por via intratecal con 10^5 DICT50 particulas virales infectivas del aislamiento IG-26/93 se reaislo el virus de sangre, 72 h despues de la infeccion (12). En los experimentos descritos en las tablas 2 y 3 no se hicieron analisis de reaislamiento del virus a partir de sangre.

La hipotesis patogenica

Nuestra hipotesis emplea dos elementos fundamentales:

1. Participacion del estres por deficit vitaminico y otras causas. El estres puede aumentar la susceptibilidad a enfermedades incluyendo aquellas provocadas por infecciones virales (13).

2. Papel del virus en el dano neurologico. Como se muestra en la Tabla 4, el virus parece compartir determinantes antigenicos con componentes del sistema nervioso que pudieran propiciar una reaccion autoinmune (algo similar a lo postulado por algunos para la esclerosis multiple (14, 15)).

Tabla 4. Caracterizacion de la reaccion cruzada entre los virus y estructuras del sistema nervioso.

---------------------------------------------------------------------------
Suero                               Muestra
--------------------------------------------------------------------------
           Nervio sural   Nervio sural   Nervio sural  Tejidos de ratones
          de adulto sano  de adulto con  NE de feto    inoculados con
                                                       IG/28 o IG/32 (10)
--------------------------------------------------------------------------  
Anti-C-47/IPK     +            +              -               +
Anti-IG-32/93     +        No ensayado    No ensayado    No ensayado 
Pacientes de NE   +            +              -               +
Individuos sanos  -            -              -               -
--------------------------------------------------------------------------

Estos primeros resultados nos permiten disenar nuevos experimentos que profundicen en los mecanismos etiopatogenicos de la NE.

Conclusiones

Las evidencias acumuladas hasta el presente sugieren con fuerza la participacion de un agente infeccioso dentro del cuadro de la NE, el cual juega posiblemente el papel fundamental en el dano neurologico. Se puede proponer un mecanismo mediante el cual el virus desencadene una reaccion del tipo autoinmune dirigida a estructuras del sistema nervioso.

Las lineas de trabajo que de inmediato nos pueden llevar a una conclusion definitiva estan encaminadas al estudio molecular del agente infeccioso, el desarrollo de un nuevo experimento en el modelo animal descrito y a un mayor completamiento de la hipotesis patogenica.

Referencias

1. Joklik WK, Smith DT, Wheat RW, Willett HP. Desarrollo historico de la microbiologia medica. En: Zinsser Microbiologia. Ed. por Joklik WK, Willett HP y Amos DB. Edicion Revolucionaria, La Habana, Cuba. 1984;18-19.

2. Cohen J. Fulfilling Koch's postulates. Science 1994;66:1647.

3. Duesberg PH. Inventing the AIDS virus. Regnery Publishing Inc. Washington, USA. 1996.

4. Autores varios. Neuropatia epidemica en Cuba 1992-1994. Editorial Ciencias Medicas, La Habana, 1995.

5. The Cuban Neuropathy Field Investigation Team. Epidemic optic neuropathy in Cuba -clinical characterization and risk factors. The New England J of Medicine 1995;333:1176-1182.

6. Rodriguez MP, lvarez R, Garcia del Barco D, Lopez-Saura P, Hernandez F, Labarta V, Falcon V et al. Characterization of virus isolated from the cerebrospinal fluid of patients with epidemic neuropathy. J Med Virol (in press) 1997.

7. Lopez-Saura P, Hernandez F, Labarta V, the Group for the Study of the Epidemic Neuropathy. Interferon alpha-2b in epidemic neuropathy. J Interferon Res 1994;14(Suppl. 1): S120.

8. lvarez M, Muzio V, Marrero M, Barro M, Rosario D, Jomarron L et al. Detection by polymerase chain reaction of enterovirus-like sequences in patients with epidemic neuropathy in Cuba. Biotecnologia Aplicada 1995;12: 46-51.

9. Musacchio A, Herrera L, Rodriguez P, lvarez R, Gonzalez Griego M et al. Humoral immunological response of patients with epidemic neuropathy against a virus isolated from the cerebrospinal fluid of a clinical case. Biotecnologia Aplicada 1995;12:141-151.

10. Falcon V, Reyes J, Ancheta O, Rodriguez P, lvarez R, Baranosky N et al. Study by transmission electron microscopy of virus strains isolated from the cerebrospinal fluid of patients with epidemic neuropathy. Biotecnologia Aplicada 1994;11:151-159.

11. Riego E, Marrero M, Calvo E, Bringas R, lvarez M, Mune M et al. Sequence analysis of coxsackie A9 viruses isolated during 1990-1994 in Cuba from patients with meningitis, myocarditis and epidemic neuropathy. Biotecnologia Aplicada 1994;11:145-150.

12. Castro FO, Berlanga J, Alfonso Sabatier C, Rodriguez P, Hechevarria M, Hayes O et al. Evaluation in animal models of the neurovirulence of isolates from patients with epidemic neuropathy. Biotecnologia Aplicada 1994;11: 138-144.

13. Licinio J, Gold PW, Wong Ma-Li. A molecular mechanism for stress- induced alterations in susceptibility to disease. The Lancet 1995;346:104- 106.

14. Rodriguez M. Multiple sclerosis: basic concepts and hypothesis. Mayo Clin Proc 1989;64:570-576.

15. Cohen AD, Shoenfeld Y. The viral-autoimmunity relationship. Viral Immunology 1995;8:1-9.

16. Berlanga J, Infante J, Capo V, de la Fuente J, Castro FO. Characterization of transgenic mice lineages. I. Overexpression of hGH causes the formation of liver intranuclear pseudoinclusion bodies and renal and hepatic injury. Acta Biotechnol 1993;13 (4):361-371.

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