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Biotecnologia Aplicada
Elfos Scientiae
ISSN: 0684-4551
Vol. 14, Num. 3, 1997, pp. 181-184
Biotecnologia Aplicada 1997 Volume 14 No. 3, pp. 181-184

EFECTO DE DIFERENTES METODOS DE CULTIVO SOBRE LA REGENERACION IN VITRO DE PAPA (Solanum tuberosum L.) DE LA VARIEDAD COMERCIAL CHIEFTAIN

Gil A Enriquez-Obregon, Alejandro D Fuentes, Guillermo Selman-Housein, Pilar Tellez, Natacha Soto, Marlene Perez y Pedro Oramas

Division de Plantas. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado postal 6162, CP 10600, La Habana, Cuba.
Fax: (53-7) 21 8070. E-mail: cttlab@cigb.edu.cu

Recibido en julio de 1996. Aprobado en marzo de 1997.


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ABSTRACT

The regeneration capacity of different explants of in vitro grown plantlets of potato commercial variety Chieftain was evaluated using two approaches: A, the same culture medium from callus to shoot formation and B, transfer the callus to free auxin culture medium before the shoot formation. The best regeneration frequency for this cultivar was obtained from tuber discs in the medium (MRT-6) with 3.28 shoots per explant (approach A), followed by 2.5 shoots for stem segments (MRE-4 and MRE-6 media, approach B) and 0.8 shoots in leaf discs (medium MRH-3, approach A). The combination of 1 mg/L silver nitrate with 5 g/L activated charcoal, during the micro-propagation, showed an enhancement of the leaves number per plant and its quality.

Key words: regeneration, potato, Solanum tuberosum L., in vitro culture

RESUMEN

Se evaluo la capacidad de regeneracion en explantes de hoja, tuberculos y segmentos de tallo de la variedad comercial Chieftain, utilizando dos metodos: A, el mismo medio de cultivo desde la iniciacion de los callos hasta la formacion de los brotes y B, transferencia de los callos a un medio de cultivo libre de auxinas antes de la formacion de los brotes. La mayor frecuencia de regeneracion se obtuvo de discos de tuberculo en el medio (MRT-6) (metodo A) con 3,28 brotes por explante, seguido por 2,5 brotes en segmentos de tallo (medios MRE-4 y MRE-6, metodo B) y 0,8 brotes a partir de discos de hoja (medio MRH-3, metodo A). La combinacion de 1 mg/L de nitrato de plata con 5 g/L de carbon activado, durante la propagacion in vitro, mostro diferencias significativas tanto en el numero de hojas por planta como en su calidad.

Palabras claves: regeneracion, papa, Solanum tuberosum L., cultivo in vitro

Introduccion

Por su alta productividad y contenido en carbohidratos, proteinas, vitaminas y sales minerales, la papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos de mayor relevancia para la dieta humana (1). Por esta razon es muy importante el constante mejoramiento de los parametros agricolas de las variedades de este tuberculo.

Los programas clasicos de mejoramiento genetico de la papa resultan ineficientes debido a las caracteristicas tetraploide de su genoma, y al largo periodo de tiempo que se necesita para ellos. Sin embargo, con las tecnicas del ADN recombinante es posible la modificacion de caracteres fenotipicos y la obtencion de nuevas variedades en poco tiempo. No obstante, los bajos niveles de regeneracion de muchas de estas variedades limitan el empleo extensivo de la ingenieria genetica aplicada al cultivo de la papa (2); por tanto, este evento es la clave para el exito en la transformacion genetica y la obtencion de plantas transgenicas.

La regeneracion en explantes de papa se ha dividido en 3 fases: 1) iniciacion del callo, 2) formacion de brotes derivados de callos y 3) desarrollo y definicion de los brotes. Estas etapas se han logrado empleando 2 metodos: en un paso (3), donde la iniciacion del callo, los brotes y el desarrollo de estos tienen lugar en el mismo medio de cultivo, y en 2 pasos (4), que consiste en la transferencia de los callos, con los brotes iniciados, a un medio libre de auxinas hasta la formacion definitiva de estos.

Actualmente, la var. Chieftain cubre mas del 15 % del area total cultivada de papa en Cuba. Su extension no supera este valor, por la alta susceptibilidad que presenta esta variedad a enfermedades virales y fungosas, las cuales disminuyen considerablemente los rendimientos (MINAGRI-1996, F. Manzo (comunicacion personal)).

En este trabajo se evalua la capacidad de regeneracion de 3 tipos de explantes: hojas, tuberculos y segmentos de tallos, de plantas in vitro de esta variedad, teniendo como proyeccion la transformacion genetica para la obtencion de clones resistentes a estas enfermedades. Para ello, se utilizaron ambos metodos debido a la pobre respuesta que presenta a protocolos previamente publicados.

Materiales y Metodos

El material vegetal fue tomado de plantas in vitro de la var. Chieftain, a las 4 semanas de cultivo, excepto los microtuberculos que fueron seleccionados a partir de las 6 semanas.

Para la formacion de microtuberculos se emplearon 0,5 g/L de cloruro de clorina y 5 mg/L de bencil-amino purina (BAP) sobre un medio MS (5), durante un mes de cultivo en la oscuridad. Las hojas y segmentos de tallo fueron obtenidos mediante la propagacion de yemas axilares en 4 medios de cultivo con tiosulfato de sodio mas nitrato de plata (STS) (6) y/o carbon activado (Tabla 1). El pH en los medios de cultivo fue ajustado a 5,8 antes de autoclavear. Las plantulas in vitro se mantuvieron en cuartos iluminados, con un regimen de 16 h luz por 8 h de oscuridad y una temperatura de 25 C.

Tabla 1. Compsicion de los medios de cultivo para la propagacion in vitro.

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P1    MSP, 5 g/L de carbon activado
P2    MSP, 1,0 mg/L STS (referido a 1 mg/L de nitrato de plata)
P3    MSP, 5 g/L carbon activado, 1 mg/L STS
P4    MSP (sales del medio MS, pantotenato de calcio 2 mg/L, tiamina 0,4    
          mg/L, myo-inositol 100 mg/L, sacarosa 30 g/L)
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Se realizaron analisis de varianza de clasificacion simple y las medias fueron comparadas a traves de la prueba de rangos multiples de Duncan (7).

Regeneracion

Para los experimentos en hojas se tomo la parte media, descartando ambos extremos, y se cultivo por el metodo A (de un paso) en medio basal MS con 0,01 mg/L de acido 3-indol acetico (AIA) y 2,5 mg/L de BAP, suplementado con 2,5; 5,0 y 7,5 mg/L de acido giberelico (GA3). Se probo ademas el medio CD3Z (8) (Tabla 2).

Tabla 2. Composicion de los medios de cultivo empleados para la regeneracion de hojas var. Chieftain.

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Reguladores (mg/L)    CD3Z    MRH-2    MRH-3    MRH-4
-------------------------------------------------------
Zeatina               3,0      -        -        -
AIA                   0,1     0,01     0,01     0,01
GA3                   3,0     2,5      5,0      7,5
BAP                    -      2,5      2,5      2,5
-------------------------------------------------------

Los segmentos de tallo se cortaron en secciones de 5-10 mm de longitud, descartando las yemas axilares, y fueron cultivados en una variante del medio descrito por Newell y colaboradores (9) durante 15 dias. Posteriormente fueron transferidos a 32 combinaciones hormonales con GA3 y BAP (0; 0,3; 1,0; 3,0 mg/L), suplementado o no con 1 mg/L de STS segun el metodo B (de 2 pasos) (Tabla 3).

Se tomaron discos de tuberculo de 0,3 a 0,5 mm de grosor y de 1 cm de diametro. Estos se transfirieron a un medio MS con diferentes reguladores del crecimiento y se evaluo la regeneracion utilizando ambos metodos (A y B). Para el A, se emplearon los medios descritos por Sheerman y colaboradores (10), combinados con diferentes concentraciones de zeatina (Tabla 4). En ambas etapas del metodo B, los medios se suplementaron con bajas concentraciones de GA3 (MRT-7), segun resultados obtenidos por Jain y colaboradores (11).

Tabla 3. Formulacion de los medios de cultivo usados para la regeneracion en segmentos de tallo var. Chieftain, que provocaron una respuesta positiva. 

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Etapa I
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MSP (Tabla 1); 3,0 mg/L BAP; 0,01 mg/L NAA; 1 mg/L de nitrato de plata.
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Etapa II (medio de formacion de brotes)
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MRE-1    MSP; 0,3 mg/L GA3
MRE-2    MSP; 1 mg/L GA3
MRE-3    MSP; 1 mg/L GA3; 1mg/L BAP
MRE-4    MSP; 1 mg/L GA3; 3 mg/L BAP
MRE-5    MSP; 3 mg/L GA3
MRE-6    MSP; 3 mg/L GA3; 3 mg/L BAP
---------------------------------------------------------------------------

Tabla 4. Composicion de los medios de cultivo que fueron usados para la
regeneracion de tuberculos var. Chieftain.
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A: Metodo de un paso
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Reguladores    MRT-1    MRT-2    MRT-3    MRT-4    MRT-5    MRT-6
  (mg/L)   
----------------------------------------------------------------------
Zeatina        0,25     0,50     0,75     0,50     1,00     1,50
NAA            0,30     0,30     0,30      -        -        -
BAP            1,00     1,00     1,00      -        -        -
AIA             -        -        -       0,50     0,50     0,50
----------------------------------------------------------------------
B: Metodo de 2 pasos
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Reguladores     MRT-7-1              MRT-7-2             MRT-7-3
(mg/L)    ------------------    -----------------    -----------------
           Etapa I  Etapa II    Etapa I  Etapa II    Etapa I  Etapa II
----------------------------------------------------------------------
NAA         0,01     0           0,01     0,01        0,01     0
BAP         3,0      0           3,0      1           3,0      1
GA3         0        0,1         0,001    0,1         0,01     0,3
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Resultados y Discusion

En la Figura 1 se muestran los resultados al comparar 4 medios de cultivo sobre el numero y desarrollo de las hojas durante la propagacion in vitro de la var. Chieftain. La mejor variante resulto la combinacion de carbon activado con STS (P3), que produjo 7,5 hojas por planta y 2,5 cm^2 de area promedio por cada hoja. Las variantes que contienen estos compuestos por separado (P1 y P2) tambien mejoraron estos parametros en relacion con el control sin tratar (P4). Los resultados con STS coinciden con los presentados por Perl y colaboradores (6), quienes encontraron un aumento en el area de las hojas de las variedades Pito, Bintje y Rekord, al crecer las plantas a bajas concentraciones de nitrato de plata.

    Figura 1. Efecto del STS y el carbon activado sobre el desarrollo de las hojas var. Chieftain. (Tabla 1). Los valores con igual letra significan que no existen diferencias para p < 0,05 segun el test de Duncan (7).

El uso del carbon activado y el STS durante la propagacion in vitro de las plantas se justifica por la prolongacion de los estados juveniles, expresados en una consistencia blanda de los tejidos y el color verde intenso de las hojas por largos periodos de tiempo. Sin embargo, las plantas de las variantes P2 y P3 (ambas con la influencia de nitrato de plata) alcanzaron una altura promedio menor, y la adicion consecutiva de STS en varios subcultivos provoco una drastica disminucion del crecimiento (12), combinada con la aparicion de manchas moradas en el enves de las hojas. El nitrato de plata se une a receptores de etileno (13), bloqueando la accion de este regulador sobre los tejidos de la planta, mientras que el carbon activado retiene los compuestos fenolicos en el medio de cultivo (14); ambos metabolitos (etileno y compuestos fenolicos), producen alteraciones en el desarrollo de las plantas crecidas in vitro. Los explantes de hojas, tomados de la variante P3, mostraron un incremento en los niveles de regeneracion de un 30 % en relacion con las hojas provenientes de P4 (datos no mostrados). Sin embargo, teniendo en cuenta la antes mencionada toxicidad, provocada por los iones de plata, recomendamos utilizar subcultivos alternos en ambos medios durante el cultivo in vitro de las plantas de papa.

Las hojas mostraron una baja frecuencia de regeneracion (0,2 brotes por explante) en el medio CD3Z (Figura 2). Los mejores resultados en esta variedad fueron obtenidos en el medio MRH-3, aunque los mismos continuaron siendo muy moderados (0,8 brotes por explante).

    Figura 2. Determinacion de la eficiencia de regeneracion de hojas var. Chieftain. (Tabla 2). Los valores con igual letra significan que no existen diferencias para p < 0,05 segun el test de Duncan (7).

Los callos obtenidos de segmentos de tallo estaban parcialmente pigmentados, pero este hecho no imposibilito la regeneracion de plantas en algunas de las variantes evaluadas (Figura 3). Los mejores resultados en estos experimentos se correspondieron con los medios MRE-4 y MRE-6 con 2,5 brotes por explante, donde la combinacion de 3 mg/L de BAP con 1 y 3 mg/L de GA3, respectivamente, constituyo un elemento fundamental para la regeneracion de este tipo de explante. La presencia de STS produjo un efecto sobre el numero de brotes que fue dependiente del medio empleado para la regeneracion; indicando un posible efecto sinergico entre las hormonas adicionadas al cultivo y el etileno generado por las celulas vegetales. Para las variantes MRE-4 y MRE-6, el efecto del STS fue desfavorable (Figura 3); mientras que la adicion de 1 mg/L de nitrato de plata, en las variantes sin BAP, provoco un aumento en el numero de brotes por explante.

    Figura 3. Regeneracion de papa var. Chieftain a partir de segmentos de tallo (representacion de las variantes que provocaron una respuesta positiva, de las 32 ensayadas) (Tabla 3). Los valores con igual letra significan que no existen diferencias para p < 0,05 segun el test de Duncan (7).

La mayor frecuencia de regeneracion se produjo a partir de discos de tuberculo, con 3,28 brotes por explante, utilizando el metodo A (medio MRT- 6) (Figura 4). Este valor difiere significativamente del resto de las variantes que aparecen en la Tabla 4.

    Figura 4. Influencia del metodo y los medios de cultivo sobre la regeneracion de tuberculos in vitro de la var. Chieftain (brotes/explante), (Tabla 4). Los valores con igual letra significan que no existen diferencias para p < 0,05 segun el test de Duncan (7).

En la Figura 4 se muestran otros resultados obtenidos despues de cultivar discos de tuberculo mediante el metodo B, con la presencia de bajos niveles de GA3 en ambas etapas (MRT-7). Los valores de 0,5 y 0,3 brotes por explante, logrados en las combinaciones MRT-7-2 y MRT-7-3, respectivamente, resultaron menores a las obtenidas en las variantes MRT-5 y MRT-6 (Tabla 4). Sin embargo Jain y colaboradores (11) reportaron 4 brotes por explante al cultivar discos de tuberculo en la variante MRT-7-2, a una temperatura de 19 C y en un periodo de 4 semanas.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Ing. Gerardo Garcia Illera por su valiosa ayuda durante el procesamiento estadistico en los diferentes experimentos.

References

1. Sasson AL. La alimentacion del hombre del manana. UNESCO/EDITORIAL REVERTE, S.A. 1993;3:563-565.

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4. Wenzler H, Mignery G, May G, Park W. A rapid and efficient transformation method for the production of large numbers of transgenic potato plants. Plant Sci 1989;63:79-85.

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10. Sheerman S, Bevan MW. A rapid transformation method for Solanum tuberosum L. using binary Agrobacterium tumefaciens vectors. Plant Cell Rep 1988;7:13-16.

11. Jain SM, Jokinen K, Virta U. Factors affecting on shoots regeneration in cultured of potato (Solanum tuberosum L.) tuber discs (in press).

12. Block MD. Genotype-independent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum L.) using Agrobacterium tumefaciens. The Appl Genet 1988; 76:767-774.

13. Ahoroni N, Anderson JD, Lieberman M. Production and action of ethylene in senescing leaf discs. Effects of indoleacetic acid, kinetin, silver ion and carbon dioxide. Plant Physiol 1979;64: 805-809.

14. Vasil IK. Regulation of the phenolic compounds in plant tissue culture. Cell culture and somatic cell genetics of plants 1984;4:262-263.

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